免疫共沉淀(Co-Immunoprecipitation,Co-IP)的優(yōu)點(diǎn)主要包括:高度特異性:免疫共沉淀利用高親和力的抗體與目標(biāo)蛋白結(jié)合,能夠高度特異性地識(shí)別目標(biāo)蛋白質(zhì),從而減少假陽(yáng)性和假陰性的誤差,提高實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性。可控性強(qiáng):免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)的反應(yīng)條件相對(duì)穩(wěn)定,實(shí)驗(yàn)長(zhǎng)度、溫度、蛋白濃度、抗體濃度等可被有效控制,這樣可以有效地減少誤差和變異性。可用于研究蛋白相互作用:免疫共沉淀不僅可以檢測(cè)單個(gè)蛋白質(zhì),還可以研究蛋白質(zhì)之間的相互作用,從而揭示蛋白質(zhì)的組裝和功能。這對(duì)于理解細(xì)胞內(nèi)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、代謝途徑等復(fù)雜生物過(guò)程具有重要意義。天然狀態(tài):通過(guò)免疫共沉淀得到的蛋白質(zhì)相互作用是在自然狀態(tài)下進(jìn)行的,...
IP-WB(免疫沉淀-Western Blot)實(shí)驗(yàn)要點(diǎn)主要包括以下幾個(gè)步驟:樣品制備:確保樣品新鮮且未經(jīng)過(guò)多次凍融,以避免蛋白降解。裂解細(xì)胞或組織,獲得含有目標(biāo)蛋白及其相互作用伙伴的裂解液。免疫沉淀:選擇特異性強(qiáng)的抗體,與目標(biāo)蛋白結(jié)合形成復(fù)合物。將復(fù)合物與固相載體(如磁珠)結(jié)合,通過(guò)洗滌去除非特異性結(jié)合的雜質(zhì)。電泳分離:將免疫沉淀得到的蛋白質(zhì)復(fù)合物進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳,按照分子量大小分離蛋白質(zhì)。Western Blot檢測(cè):將電泳后的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到固相膜上,利用特異性抗體檢測(cè)目標(biāo)蛋白或其相互作用伙伴的存在。通過(guò)顯色反應(yīng)可視化目標(biāo)蛋白,確保特異性結(jié)合。結(jié)果分析:觀察Western Blo...
Co-IP實(shí)驗(yàn)操作要點(diǎn)主要包括:1.樣品處理:確保樣品新鮮且未經(jīng)過(guò)多次凍融,以避免蛋白降解。對(duì)于組織樣本,應(yīng)在取樣后立即置于適當(dāng)?shù)谋4鏃l件下。2.抗體選擇:選擇特異性強(qiáng)的抗體,這是減少非特異性結(jié)合和背景噪聲的關(guān)鍵。3.抗體與磁珠偶聯(lián):將抗體與磁珠充分偶聯(lián),確??贵w能夠捕獲目標(biāo)蛋白。4.樣品與抗體-磁珠復(fù)合物結(jié)合:將處理好的樣品與抗體-磁珠復(fù)合物混合,確保目標(biāo)蛋白與抗體充分結(jié)合。5.洗滌:使用適當(dāng)?shù)南礈炀彌_液徹底洗滌磁珠,以去除非特異性結(jié)合的蛋白。6.洗脫與檢測(cè):使用適當(dāng)?shù)南疵摼彌_液將目標(biāo)蛋白從磁珠上洗脫下來(lái),并進(jìn)行后續(xù)的分析和檢測(cè)。7.遵循這些操作要點(diǎn),可以確保Co-IP實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠...
Co-IP實(shí)驗(yàn)的外源檢測(cè)與內(nèi)源檢測(cè)各有其優(yōu)缺點(diǎn)。外源檢測(cè)的優(yōu)點(diǎn)在于其可控性高,能精確地表達(dá)目標(biāo)蛋白及其標(biāo)簽,且背景清晰,易于檢測(cè)。此外,外源檢測(cè)系統(tǒng)通常更為敏感,能夠檢測(cè)到較弱的相互作用。然而,其缺點(diǎn)也顯而易見(jiàn),即不能完全模擬體內(nèi)的真實(shí)環(huán)境,可能導(dǎo)致某些體內(nèi)特有的相互作用無(wú)法被檢測(cè)到。內(nèi)源檢測(cè)則能更真實(shí)地反映生物體內(nèi)的蛋白質(zhì)相互作用情況,因?yàn)樗苯永眉?xì)胞內(nèi)的天然蛋白。然而,這種方法的挑戰(zhàn)在于細(xì)胞內(nèi)蛋白表達(dá)的復(fù)雜性和多樣性,可能導(dǎo)致背景噪聲高,難以準(zhǔn)確檢測(cè)目標(biāo)蛋白。此外,內(nèi)源檢測(cè)的靈敏度通常較外源檢測(cè)低。綜上所述,選擇外源檢測(cè)還是內(nèi)源檢測(cè),需根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康暮途唧w情況來(lái)權(quán)衡。如需高靈敏度和可控性,...
免疫共沉淀(Co-Immunoprecipitation,Co-IP)的局限性主要包括:可能檢測(cè)不到低親和力和瞬間的相互作用:低親和力和瞬間的蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)之間的相互作用可能檢測(cè)不到,這可能導(dǎo)致某些重要的相互作用被遺漏。不能確保直接相互作用:免疫共沉淀不能保證沉淀的蛋白復(fù)合物是由直接相互作用的兩種蛋白組成。兩種蛋白質(zhì)的結(jié)合可能不是直接結(jié)合,而可能有第三者在中間起橋梁作用。靈敏度限制:免疫共沉淀的靈敏度不如某些其他技術(shù),如親和色譜,這可能影響到對(duì)低豐度蛋白或微弱相互作用的研究。樣本純度要求高:如果將蛋白復(fù)合物直接進(jìn)行質(zhì)譜分析,需要得到較高純度和濃度的蛋白復(fù)合物樣品,這并非易事,并且成本較高。對(duì)抗...
Co-IP(免疫共沉淀)技術(shù)是一種在生物學(xué)研究中廣泛應(yīng)用的實(shí)驗(yàn)方法,主要用于研究蛋白質(zhì)之間的相互作用。該技術(shù)利用特異性抗體與目標(biāo)蛋白結(jié)合,形成免疫復(fù)合物,并通過(guò)與磁珠或瓊脂糖等固相支持物的結(jié)合,將復(fù)合物從復(fù)雜的細(xì)胞或組織提取物中分離出來(lái)。這種分離過(guò)程是在非變性條件下進(jìn)行的,因此可以保留蛋白質(zhì)間的天然相互作用狀態(tài)。Co-IP技術(shù)的主要優(yōu)勢(shì)在于其直接性、特異性和靈敏度。通過(guò)選擇特異性強(qiáng)的抗體,研究人員能夠準(zhǔn)確地捕獲目標(biāo)蛋白及其相互作用伙伴,從而揭示蛋白質(zhì)在生命過(guò)程中的功能和調(diào)控機(jī)制。此外,該技術(shù)還可以用于研究間接相互作用的蛋白,如蛋白復(fù)合物的多種成分??傊?,Co-IP技術(shù)為深入研究蛋白質(zhì)相互作用提...
免疫共沉淀與免疫沉淀技術(shù)所使用的原理與方法大致相似,所不同的是,在免疫共沉淀中,對(duì)靶蛋白的結(jié)合與沉淀由另一個(gè)與之發(fā)生相互作用的蛋白替代。在免疫共沉淀或免疫沉淀的基礎(chǔ)上,通過(guò)進(jìn)一步與其它技術(shù)的結(jié)合,如聚丙烯酰胺凝膠電泳,還可進(jìn)一步對(duì)靶蛋白的的分子量等特性進(jìn)行鑒定。 免疫沉淀(Immunoprecipitation,IP):利用抗原抗體特異性反應(yīng),對(duì)某個(gè)特定蛋白純化富集的方法,主要過(guò)程包括捕獲和固定。(2)免疫共沉淀(Co-Immunoprecipitation,CoIP):CoIP是在IP實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上進(jìn)行的擴(kuò)展,主要用于蛋白之間的互作研究,常被用于鑒定特定蛋白復(fù)合物的中已知或未知的蛋白...
IP-WB(免疫沉淀-Western Blot)是一種常用的實(shí)驗(yàn)方法,用于驗(yàn)證蛋白質(zhì)之間的相互作用。在IP-WB實(shí)驗(yàn)中,首先使用特異性抗體將目標(biāo)蛋白從細(xì)胞或組織裂解液中免疫沉淀下來(lái)。這一步驟確保了只有與目標(biāo)蛋白特異性結(jié)合的蛋白質(zhì)被富集。隨后,將免疫沉淀得到的蛋白質(zhì)復(fù)合物進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳,使蛋白質(zhì)按照分子量大小分離。接著,通過(guò)Western Blot技術(shù),利用特異性抗體檢測(cè)目標(biāo)蛋白或其相互作用伙伴的存在。Western Blot利用抗體與蛋白質(zhì)的特異性結(jié)合,通過(guò)顯色反應(yīng)可視化目標(biāo)蛋白,從而實(shí)現(xiàn)對(duì)蛋白質(zhì)相互作用的驗(yàn)證。IP-WB技術(shù)結(jié)合了免疫沉淀的高特異性與Western Blot的高...
免疫共沉淀(Co-Immunoprecipitation,Co-IP)是一種在生物藥物領(lǐng)域廣泛應(yīng)用的技術(shù),主要用于研究蛋白質(zhì)之間的相互作用。該技術(shù)通過(guò)利用特異性抗體將目標(biāo)蛋白與其相互作用的蛋白一同沉淀下來(lái),從而揭示蛋白質(zhì)間的相互作用關(guān)系。在蛋白泛素化研究方面,Co-IP技術(shù)也發(fā)揮著重要作用。通過(guò)該技術(shù),研究人員可以鑒定并驗(yàn)證與泛素連接酶和泛素受體相互作用的蛋白質(zhì),進(jìn)一步揭示泛素化修飾的調(diào)控機(jī)制。同時(shí),結(jié)合質(zhì)譜分析,Co-IP技術(shù)還可以鑒定泛素化修飾的靶標(biāo)蛋白質(zhì)及其相互作用蛋白質(zhì),揭示泛素化修飾在細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)、代謝調(diào)控等生命過(guò)程中的功能和調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。Co-IP(免疫共沉淀)技術(shù)應(yīng)用場(chǎng)景。廣西蛋白蛋...
IP-Mass(免疫沉淀-質(zhì)譜)技術(shù)是一種結(jié)合了免疫沉淀和質(zhì)譜分析的方法,用于研究蛋白質(zhì)相互作用和差異蛋白質(zhì)分析。該技術(shù)首先利用特異性抗體與目標(biāo)蛋白結(jié)合,形成抗原-抗體復(fù)合物。然后,這些復(fù)合物被吸附到固相載體上,經(jīng)過(guò)洗滌步驟去除非特異性結(jié)合的雜質(zhì)。接下來(lái),蛋白質(zhì)復(fù)合物從載體上洗脫下來(lái),并通過(guò)質(zhì)譜分析進(jìn)行鑒定和檢測(cè)。質(zhì)譜分析是IP-Mass技術(shù)的重要部分,它可以提供關(guān)于蛋白質(zhì)的質(zhì)量、荷質(zhì)比和豐度等信息。通過(guò)對(duì)質(zhì)譜數(shù)據(jù)的分析,可以鑒定出與目標(biāo)蛋白相互作用的蛋白質(zhì),以及蛋白質(zhì)之間的相互作用強(qiáng)度和特異性。然而,IP-Mass技術(shù)也存在一些局限性,如抗體特異性、樣品制備和實(shí)驗(yàn)條件等因素可能對(duì)結(jié)果產(chǎn)生影響...
在CoIP(免疫共沉淀)實(shí)驗(yàn)中,對(duì)照組的設(shè)置對(duì)于驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性至關(guān)重要。對(duì)照組的主要目的是排除非特異性結(jié)合和背景干擾,從而更準(zhǔn)確地評(píng)估目標(biāo)蛋白與誘餌蛋白之間的相互作用。陰性對(duì)照組設(shè)計(jì)建議:1. 無(wú)抗體對(duì)照組:在免疫沉淀步驟中不加入特異性抗體,以檢測(cè)是否存在非特異性結(jié)合。如果在此條件下仍然檢測(cè)到目標(biāo)蛋白,則可能是非特異性結(jié)合,需要在分析時(shí)予以排除。2. 無(wú)關(guān)抗體對(duì)照組:使用與誘餌蛋白和靶蛋白均無(wú)關(guān)的抗體進(jìn)行免疫沉淀,以驗(yàn)證特異性抗體的作用。如果在此條件下未檢測(cè)到目標(biāo)蛋白,則可以增強(qiáng)對(duì)特異性抗體所檢測(cè)到的相互作用的信心。Co-IP外源檢測(cè)需注意蛋白互作真實(shí)性、表達(dá)系統(tǒng)與標(biāo)簽選擇、規(guī)范...
IP-Mass(免疫沉淀-質(zhì)譜)實(shí)驗(yàn)流程主要包括以下步驟:樣品制備:收集細(xì)胞或組織樣品,并進(jìn)行適當(dāng)?shù)牧呀馓幚恚葬尫偶?xì)胞內(nèi)的蛋白質(zhì)。免疫沉淀:將特異性抗體與目標(biāo)蛋白結(jié)合,形成抗原-抗體復(fù)合物。隨后,將復(fù)合物與固相載體(如磁珠)結(jié)合,通過(guò)洗滌步驟去除非特異性結(jié)合的雜質(zhì)。洗脫:從固相載體上洗脫免疫沉淀得到的蛋白質(zhì)復(fù)合物,以便進(jìn)行后續(xù)的質(zhì)譜分析。蛋白酶消化:將洗脫下來(lái)的蛋白質(zhì)復(fù)合物進(jìn)行蛋白酶消化,將其分解成小分子的肽段。質(zhì)譜分析:將消化后的肽段進(jìn)行質(zhì)譜分析,通過(guò)測(cè)量肽段的質(zhì)量和電荷信息,鑒定出蛋白質(zhì)的種類和序列。數(shù)據(jù)分析:對(duì)質(zhì)譜數(shù)據(jù)進(jìn)行處理和分析,確定與目標(biāo)蛋白相互作用的蛋白質(zhì),以及相互作用的可能性...
IP-Mass(免疫沉淀-質(zhì)譜)技術(shù)是一種結(jié)合了免疫沉淀和質(zhì)譜分析的方法,用于研究蛋白質(zhì)相互作用和差異蛋白質(zhì)分析。該技術(shù)首先利用特異性抗體與目標(biāo)蛋白結(jié)合,形成抗原-抗體復(fù)合物。然后,這些復(fù)合物被吸附到固相載體上,經(jīng)過(guò)洗滌步驟去除非特異性結(jié)合的雜質(zhì)。接下來(lái),蛋白質(zhì)復(fù)合物從載體上洗脫下來(lái),并通過(guò)質(zhì)譜分析進(jìn)行鑒定和檢測(cè)。質(zhì)譜分析是IP-Mass技術(shù)的重要部分,它可以提供關(guān)于蛋白質(zhì)的質(zhì)量、荷質(zhì)比和豐度等信息。通過(guò)對(duì)質(zhì)譜數(shù)據(jù)的分析,可以鑒定出與目標(biāo)蛋白相互作用的蛋白質(zhì),以及蛋白質(zhì)之間的相互作用強(qiáng)度和特異性。IP-Mass技術(shù)在生物學(xué)和醫(yī)學(xué)研究中具有廣泛的應(yīng)用價(jià)值。它不僅可以用于研究蛋白質(zhì)相互作用,還可以...
IP-Mass(免疫沉淀-質(zhì)譜)技術(shù)是一種結(jié)合了免疫沉淀和質(zhì)譜分析的方法,用于研究蛋白質(zhì)相互作用和差異蛋白質(zhì)分析。該技術(shù)首先利用特異性抗體與目標(biāo)蛋白結(jié)合,形成抗原-抗體復(fù)合物。然后,這些復(fù)合物被吸附到固相載體上,經(jīng)過(guò)洗滌步驟去除非特異性結(jié)合的雜質(zhì)。接下來(lái),蛋白質(zhì)復(fù)合物從載體上洗脫下來(lái),并通過(guò)質(zhì)譜分析進(jìn)行鑒定和檢測(cè)。質(zhì)譜分析是IP-Mass技術(shù)的重要部分,它可以提供關(guān)于蛋白質(zhì)的質(zhì)量、荷質(zhì)比和豐度等信息。通過(guò)對(duì)質(zhì)譜數(shù)據(jù)的分析,可以鑒定出與目標(biāo)蛋白相互作用的蛋白質(zhì),以及蛋白質(zhì)之間的相互作用強(qiáng)度和特異性。然而,IP-Mass技術(shù)也存在一些局限性,如抗體特異性、樣品制備和實(shí)驗(yàn)條件等因素可能對(duì)結(jié)果產(chǎn)生影響...
Co-IP技術(shù)作為研究蛋白質(zhì)相互作用的重要手段,其結(jié)果在多數(shù)情況下是可靠的。然而,該技術(shù)也存在一些潛在的限制和影響因素,需要研究人員予以注意。在實(shí)際應(yīng)用中,由于細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)種類繁多且相互作用復(fù)雜,可能會(huì)出現(xiàn)非特異性結(jié)合或背景噪聲,這要求研究者選擇特異性強(qiáng)的抗體,并通過(guò)洗滌步驟去除雜質(zhì)。此外,樣品的純度、抗體的質(zhì)量和實(shí)驗(yàn)條件等也會(huì)對(duì)結(jié)果產(chǎn)生影響,因此,對(duì)抗體的選擇和驗(yàn)證、樣品的準(zhǔn)備以及實(shí)驗(yàn)條件的控制都至關(guān)重要。為了進(jìn)一步提高結(jié)果的準(zhǔn)確性,研究人員通常會(huì)結(jié)合多種方法進(jìn)行相互驗(yàn)證,如使用不同抗體或?qū)嶒?yàn)條件重復(fù)實(shí)驗(yàn),或結(jié)合質(zhì)譜技術(shù)來(lái)驗(yàn)證Co-IP的結(jié)果。這些措施共同增強(qiáng)了Co-IP技術(shù)結(jié)果的可靠性。免...
免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)步驟主要包括以下五個(gè)部分:樣品處理:將細(xì)胞或組織樣品進(jìn)行裂解,得到待檢測(cè)的蛋白質(zhì)混合物,并加入蛋白酶抑制劑以避免目標(biāo)蛋白被降解。抗體處理:將專一的抗體連接到親和樹脂上,如蛋白A的親和樹脂或蛋白G的親和樹脂,或?qū)⒌鞍着c其特異性抗體結(jié)合,新形成的復(fù)合物與封閉劑緩慢搖擺在二氧化硅珠上,使碘酸鈣交聯(lián)后節(jié)制反應(yīng)。免疫共沉淀:將有抗體樹脂的樣品與吸附抗體樹脂形成免疫復(fù)合物。洗滌:采用洗滌緩沖液對(duì)樣品進(jìn)行洗滌,以去除非特異性的蛋白質(zhì)和雜質(zhì),同時(shí)盡量避免對(duì)復(fù)合物的影響。洗滌緩沖液選擇對(duì)樣品不會(huì)引起較大影響的緩沖液和洗滌劑。蛋白鑒定:將沉淀的復(fù)合物通過(guò)SDS-PAGE分離出來(lái),并進(jìn)行Western...
免疫共沉淀CoIP實(shí)驗(yàn),細(xì)胞的收集及裂解方法如下: 收集2E7個(gè)細(xì)胞樣品,加入PBS洗滌細(xì)胞,離心后棄上清收集細(xì)胞沉淀。 準(zhǔn)備500μl預(yù)冷的CellLysisBuffer,分別加入5μlProteaseInhibitor、5μlPMSF,混勻后加進(jìn)細(xì)胞沉淀中吹打均勻,冰上孵育30min,期間渦旋混勻幾次。 4℃,12000rpm離心10min,取上清,進(jìn)行蛋白濃度測(cè)定及后續(xù)實(shí)驗(yàn)。廣州基云生物,在IP互作組檢測(cè)和關(guān)鍵機(jī)制分子篩選驗(yàn)證領(lǐng)域,具有豐富的經(jīng)驗(yàn),助力您的互作機(jī)制研究,歡迎垂詢合作。 Co-IP技術(shù)廣泛應(yīng)用于生物醫(yī)學(xué)、藥物研發(fā)、蛋白質(zhì)組學(xué)等領(lǐng)域,助力科研人員探索生命...
在CoIP(免疫共沉淀)實(shí)驗(yàn)中,技術(shù)重復(fù)和生物重復(fù)設(shè)計(jì)建議如下:進(jìn)行多次技術(shù)重復(fù)(在同一實(shí)驗(yàn)條件下使用不同的樣品或樣品批次)和生物重復(fù)(使用來(lái)自不同生物或不同實(shí)驗(yàn)條件的樣品),以評(píng)估結(jié)果的穩(wěn)定性和可靠性。在設(shè)置對(duì)照組時(shí),還需要注意以下幾點(diǎn):對(duì)照組的設(shè)置應(yīng)遵循科學(xué)原理,并充分考慮實(shí)驗(yàn)的具體需求和目標(biāo)。確保對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組在實(shí)驗(yàn)條件和操作步驟上保持一致,以便進(jìn)行準(zhǔn)確的比較。在分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果時(shí),應(yīng)綜合考慮對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組的數(shù)據(jù),以得出更準(zhǔn)確的結(jié)論??傊贑oIP實(shí)驗(yàn)中,通過(guò)精心設(shè)計(jì)和執(zhí)行對(duì)照組實(shí)驗(yàn),可以提高實(shí)驗(yàn)的準(zhǔn)確性和可靠性,從而更準(zhǔn)確地評(píng)估目標(biāo)蛋白與誘餌蛋白之間的相互作用。CoIP實(shí)驗(yàn)需多次重復(fù),科...
CoIP-Mass和CoIP-WB檢測(cè)要點(diǎn): 互作蛋白篩選和驗(yàn)證:數(shù)據(jù)分析以非標(biāo)定量信號(hào)強(qiáng)度(LFQintensity和FC>10)作為強(qiáng)陽(yáng)篩選,以文獻(xiàn)查閱,功能匹配,批量CoIP-WB驗(yàn)證,提高驗(yàn)證成功率。理想CoIP-MS結(jié)果的蛋白定量都到超過(guò)1000種蛋白。其中絕大部分蛋白為非特異結(jié)合或背景蛋白。以目的蛋白的富集信號(hào)強(qiáng)度和差異倍數(shù)作為參考(相對(duì)強(qiáng)信號(hào)和差異),分析實(shí)驗(yàn)組中明顯定量較高且差異較大的蛋白,作為重要候選蛋白。同時(shí)對(duì)重要候選蛋白進(jìn)行STRING互作分析,文獻(xiàn)分析,目的蛋白功能匹配分析,選擇Top的4-5個(gè)蛋白進(jìn)行CoIP-WB驗(yàn)證,提高CoIP-WB成功率。 免疫共...
Co-IP實(shí)驗(yàn)的內(nèi)源檢測(cè)注意事項(xiàng)如下:首先,確保使用的抗體具有高特異性和親和力,這是內(nèi)源檢測(cè)成功的關(guān)鍵。由于細(xì)胞內(nèi)蛋白表達(dá)復(fù)雜,非特異性結(jié)合可能導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)結(jié)果失真。其次,嚴(yán)格控制實(shí)驗(yàn)條件,如細(xì)胞裂解和洗滌條件,以避免破壞蛋白質(zhì)相互作用或引入非特異性蛋白。溫和地釋放細(xì)胞內(nèi)蛋白,保證釋放出的蛋白不被蛋白酶分解,同時(shí)實(shí)驗(yàn)過(guò)程需保持低溫。此外,注意樣本的采集和處理。樣本應(yīng)盡快處理,避免蛋白降解,同時(shí)防止樣本在運(yùn)輸過(guò)程中溫度過(guò)高導(dǎo)致變質(zhì)。另外,結(jié)合其他實(shí)驗(yàn)方法進(jìn)行驗(yàn)證,如Western Blot等,以確認(rèn)Co-IP實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可靠性。綜上所述,Co-IP實(shí)驗(yàn)的內(nèi)源檢測(cè)需要關(guān)注抗體選擇、實(shí)驗(yàn)條件控制、樣本處理...
對(duì)于Co-IP實(shí)驗(yàn)初學(xué)者,常遇到的“坑”主要有:首先,抗體選擇至關(guān)重要。選擇特異性不強(qiáng)或親和力低的抗體,可能導(dǎo)致非特異性結(jié)合,干擾實(shí)驗(yàn)結(jié)果。因此,選擇經(jīng)過(guò)驗(yàn)證的高質(zhì)量抗體是關(guān)鍵。其次,實(shí)驗(yàn)操作規(guī)范不容忽視。細(xì)胞裂解不充分、洗滌不當(dāng)?shù)榷紩?huì)影響蛋白復(fù)合物的純化,進(jìn)而影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果。初學(xué)者應(yīng)嚴(yán)格按照步驟操作,確保每一步都精確無(wú)誤。再者,結(jié)果解讀需謹(jǐn)慎。初學(xué)者可能因經(jīng)驗(yàn)不足,誤將非特異性結(jié)合視為真實(shí)相互作用。因此,解讀結(jié)果時(shí),需結(jié)合其他實(shí)驗(yàn)方法如Western Blot進(jìn)行驗(yàn)證。另外,實(shí)驗(yàn)安全不可忽視。遵守實(shí)驗(yàn)室規(guī)章制度,注意個(gè)人防護(hù)和實(shí)驗(yàn)室衛(wèi)生,是確保實(shí)驗(yàn)順利進(jìn)行的基礎(chǔ)。綜上所述,初學(xué)者在進(jìn)行Co-I...
CoIP-Mass應(yīng)用場(chǎng)景:CoIP-Mass:用于構(gòu)建目的蛋白的蛋白互作組數(shù)據(jù),或用于不同遺傳背景/實(shí)驗(yàn)條件下的互作組差異。CoIP-WB:用于驗(yàn)證目的蛋白和候選蛋白的相互作用關(guān)系,或用于不同遺傳背景/實(shí)驗(yàn)條件下的互作變化。 CoIP-Mass和CoIP-WB技術(shù)價(jià)值:(1)蛋白質(zhì)相互作用數(shù)據(jù)是機(jī)制研究的重要基礎(chǔ)內(nèi)容,體現(xiàn)機(jī)制研究的嚴(yán)謹(jǐn)性,能明顯提高臨床基礎(chǔ)類研究文章的檔次。(2)細(xì)胞內(nèi)蛋白互作處于動(dòng)態(tài)變化過(guò)程,在不同條件下可發(fā)生動(dòng)態(tài)變化,蛋白動(dòng)態(tài)互作組檢測(cè),是蛋白互作機(jī)制的亮點(diǎn)。(3)蛋白互作,往往是結(jié)構(gòu)域或部分關(guān)鍵區(qū)段的互作,可通過(guò)蛋白區(qū)段拆分,進(jìn)一步明確互作的結(jié)構(gòu)域,提升機(jī)制...
免疫共沉淀(Co-Immunoprecipitation,Co-IP)的局限性主要包括:可能檢測(cè)不到低親和力和瞬間的相互作用:低親和力和瞬間的蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)之間的相互作用可能檢測(cè)不到,這可能導(dǎo)致某些重要的相互作用被遺漏。不能確保直接相互作用:免疫共沉淀不能保證沉淀的蛋白復(fù)合物是由直接相互作用的兩種蛋白組成。兩種蛋白質(zhì)的結(jié)合可能不是直接結(jié)合,而可能有第三者在中間起橋梁作用。靈敏度限制:免疫共沉淀的靈敏度不如某些其他技術(shù),如親和色譜,這可能影響到對(duì)低豐度蛋白或微弱相互作用的研究。樣本純度要求高:如果將蛋白復(fù)合物直接進(jìn)行質(zhì)譜分析,需要得到較高純度和濃度的蛋白復(fù)合物樣品,這并非易事,并且成本較高。對(duì)抗...
IP-WB(免疫沉淀-Western Blot)技術(shù)的缺點(diǎn)主要包括以下幾個(gè)方面:抗體特異性要求:IP-WB技術(shù)對(duì)抗體的特異性要求極高。如果抗體特異性不強(qiáng),可能會(huì)導(dǎo)致非特異性結(jié)合,增加背景噪聲,影響結(jié)果的準(zhǔn)確性。低豐度蛋白檢測(cè)難度:由于IP-WB技術(shù)的靈敏度限制,對(duì)于低豐度的蛋白質(zhì)相互作用,可能難以檢測(cè)到。操作復(fù)雜性:IP-WB技術(shù)涉及多個(gè)步驟,包括樣品制備、免疫沉淀、電泳分離和Western Blot檢測(cè)等,操作相對(duì)復(fù)雜,需要一定的實(shí)驗(yàn)經(jīng)驗(yàn)和技能。結(jié)果解讀難度:Western Blot結(jié)果可能受到多種因素的影響,如蛋白表達(dá)水平、抗體親和力等,結(jié)果解讀可能具有一定的難度。雖然IP-WB技術(shù)存在一...
Co-IP(免疫共沉淀)實(shí)驗(yàn)注意事項(xiàng)眾多,以確保實(shí)驗(yàn)的準(zhǔn)確性和可靠性。首先,抗體的選擇至關(guān)重要,必須選擇特異性強(qiáng)的抗體,避免非特異性結(jié)合導(dǎo)致背景噪聲。其次,樣品的處理過(guò)程需要嚴(yán)格控制,確保樣品純度和完整性,減少雜質(zhì)或降解產(chǎn)物對(duì)結(jié)果的影響。實(shí)驗(yàn)過(guò)程中,操作細(xì)節(jié)也需特別注意,如避免抗體過(guò)量使用,確保洗滌步驟充分,以去除非特異性結(jié)合的雜質(zhì)。此外,實(shí)驗(yàn)條件的選擇和優(yōu)化同樣重要,包括pH值、離子濃度、溫度等因素,都可能影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果。另外,結(jié)果的驗(yàn)證和重復(fù)實(shí)驗(yàn)也是必不可少的,通過(guò)不同抗體或?qū)嶒?yàn)條件的重復(fù)實(shí)驗(yàn),或使用其他方法進(jìn)行驗(yàn)證,如質(zhì)譜技術(shù),以提高結(jié)果的可靠性和準(zhǔn)確性??傊?,Co-IP實(shí)驗(yàn)需要注意抗體選...
CoIP-Mass是一種檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)蛋白互作組的套餐技術(shù)。該技術(shù)通過(guò)聯(lián)合免疫共沉淀技術(shù)和質(zhì)譜檢測(cè)技術(shù),對(duì)目的蛋白在特定細(xì)胞/組織內(nèi)的互作蛋白,進(jìn)行系統(tǒng)的檢測(cè)和分析。該技術(shù)適用于目的蛋白在特定細(xì)胞/組織中的蛋白互作組數(shù)據(jù)檢測(cè),或用于不同遺傳背景/實(shí)驗(yàn)條件下的互作組差異研究。因此,該技術(shù)是研究細(xì)胞內(nèi)蛋白互作調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的常規(guī)前置技術(shù)。CoIP-WB是一種檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)蛋白互作的驗(yàn)證技術(shù)。該技術(shù)通過(guò)聯(lián)合免疫共沉淀技術(shù)和WesternBlot蛋白檢測(cè)技術(shù),對(duì)目的蛋白在特定細(xì)胞/組織內(nèi)的互作關(guān)系進(jìn)行探究,明確蛋白直接的相互作用關(guān)系。該技術(shù)適用于目的蛋白在特定細(xì)胞/組織中的蛋白互作檢測(cè)驗(yàn)證,或用于不同遺傳背景/實(shí)驗(yàn)...
免疫共沉淀(Co-Immunoprecipitation,Co-IP)的局限性主要包括:可能檢測(cè)不到低親和力和瞬間的相互作用:低親和力和瞬間的蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)之間的相互作用可能檢測(cè)不到,這可能導(dǎo)致某些重要的相互作用被遺漏。不能確保直接相互作用:免疫共沉淀不能保證沉淀的蛋白復(fù)合物是由直接相互作用的兩種蛋白組成。兩種蛋白質(zhì)的結(jié)合可能不是直接結(jié)合,而可能有第三者在中間起橋梁作用。靈敏度限制:免疫共沉淀的靈敏度不如某些其他技術(shù),如親和色譜,這可能影響到對(duì)低豐度蛋白或微弱相互作用的研究。樣本純度要求高:如果將蛋白復(fù)合物直接進(jìn)行質(zhì)譜分析,需要得到較高純度和濃度的蛋白復(fù)合物樣品,這并非易事,并且成本較高。對(duì)抗...
Co-IP(免疫共沉淀)和ChIP(染色質(zhì)免疫沉淀)是兩種常用于研究蛋白質(zhì)與DNA或蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)相互作用的實(shí)驗(yàn)方法。實(shí)驗(yàn)原理方面的區(qū)別:Co-IP利用抗體與抗原之間的特異性結(jié)合,將目標(biāo)蛋白及其與之相互作用的蛋白一起拉下來(lái),進(jìn)而研究它們之間的相互作用。而ChIP則是在活細(xì)胞狀態(tài)下固定蛋白質(zhì)-DNA復(fù)合物,并通過(guò)超聲或酶處理將其隨機(jī)切斷為一定長(zhǎng)度范圍內(nèi)的染色質(zhì)小片段,然后通過(guò)抗原抗體的特異性識(shí)別反應(yīng)沉淀此復(fù)合體,特異性地富集目的蛋白結(jié)合的DNA片段。Co-IP外源檢測(cè)靈敏可控但難模擬體內(nèi)環(huán)境,內(nèi)源檢測(cè)真實(shí)但背景復(fù)雜,選擇需權(quán)衡實(shí)驗(yàn)?zāi)康?!上海蛋白蛋白互作檢測(cè)CoIP-Western BlotCo-...
免疫共沉淀(Co-Immunoprecipitation)是以抗體和抗原之間的專一性作用為基礎(chǔ)的用于研究蛋白質(zhì)相互作用的經(jīng)典方法,是確定兩種蛋白質(zhì)在完整細(xì)胞內(nèi)生理性相互作用的有效方法。其原理是:當(dāng)細(xì)胞在非變性條件下被裂解時(shí),完整細(xì)胞內(nèi)存在的許多蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)間的相互作用被保留了下來(lái)。如果用蛋白質(zhì)X的抗體免疫沉淀X,那么與X在體內(nèi)結(jié)合的蛋白質(zhì)Y也能沉淀下來(lái)。目前多用精制的prorein A預(yù)先結(jié)合固化在argarose的beads上,使之與含有抗原的溶液及抗體反應(yīng)后,beads上的prorein A就能吸附抗原達(dá)到富集的目的。這種方法常用于測(cè)定兩種目標(biāo)蛋白質(zhì)是否在體內(nèi)結(jié)合;也可用于確定一種特定蛋...
CoIP-Mass是一種檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)蛋白互作組的套餐技術(shù)。該技術(shù)通過(guò)聯(lián)合免疫共沉淀技術(shù)和質(zhì)譜檢測(cè)技術(shù),對(duì)目的蛋白在特定細(xì)胞/組織內(nèi)的互作蛋白,進(jìn)行系統(tǒng)的檢測(cè)和分析。該技術(shù)適用于目的蛋白在特定細(xì)胞/組織中的蛋白互作組數(shù)據(jù)檢測(cè),或用于不同遺傳背景/實(shí)驗(yàn)條件下的互作組差異研究。因此,該技術(shù)是研究細(xì)胞內(nèi)蛋白互作調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的常規(guī)前置技術(shù)。CoIP-WB是一種檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)蛋白互作的驗(yàn)證技術(shù)。該技術(shù)通過(guò)聯(lián)合免疫共沉淀技術(shù)和WesternBlot蛋白檢測(cè)技術(shù),對(duì)目的蛋白在特定細(xì)胞/組織內(nèi)的互作關(guān)系進(jìn)行探究,明確蛋白直接的相互作用關(guān)系。該技術(shù)適用于目的蛋白在特定細(xì)胞/組織中的蛋白互作檢測(cè)驗(yàn)證,或用于不同遺傳背景/實(shí)驗(yàn)...