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Real-time PCR的染料法和探針法的選擇：進行mRNA表達量的測定，采用染料法是比較經(jīng)濟實惠的；染料法可以通過比較熔解曲線的熔解峰位置得到產(chǎn)物特異性的情況；目的基因和內(nèi)參基因分管檢測，染料法可以選用Realtime染料PCRPreMIX，探針法主要應(yīng)用于病毒RNA的檢測；以及單位點突變（SNP）；多基因的合并檢測，探針法還可用于同一個反應(yīng)中同時檢測目的基因和內(nèi)參基因的情況；而染料法則必須分管檢測。Real-time PCR：實時熒光定量PCR技術(shù)（Real-timequantitativePolymeraseChainReaction簡稱Real-time PCR）是在定性PCR技術(shù)基...

Real-time PCR-傳統(tǒng)定量PCR：1）內(nèi)參照法：在不同的PCR反應(yīng)管中加入已定量的內(nèi)標和引物，內(nèi)標用基因工程方法合成。上游引物用熒光標記，下游引物不標記。在模板擴增的同時，內(nèi)標也被擴增。在PCR產(chǎn)物中，由于內(nèi)標與靶模板的長度不同，二者的擴增產(chǎn)物可用電泳或高效液相分離開來，分別測定其熒光強度，以內(nèi)標為對照定量待檢測模板。2）競爭法：選擇由突變克隆產(chǎn)生的含有一個新內(nèi)切位點的外源競爭性模板。在同一反應(yīng)管中，待測樣品與競爭模板用同一對引物同時擴增（其中一個引物為熒光標記）。定量聚合酶鏈反應(yīng)或者實時聚合酶鏈反應(yīng)不要與逆轉(zhuǎn)錄允許估計樣品中存在的給定序列的量。南京骨頭熒光PCR服務(wù)Real-tim...

Real-time PCR螢光染料摻入法:在PCR反應(yīng)體系中，加入過量SYBR螢光染料，SYBR螢光染料特異性地摻入DNA雙鏈后，發(fā)射螢光信號，而不摻入鏈中的SYBR染料分子不會發(fā)射任何螢光信號，從而保證螢光信號的增加與PCR產(chǎn)物的增加完全同步。此方法適用于：1、靈敏度高：使用SYBR可使螢光效果增強到1000倍以上。2、通用性好,不需要設(shè)計探針,方法簡便,省時,價格低廉。3、通用型方法，在國內(nèi)外科研中普遍使用。4、高通量大規(guī)模的定量PCR檢測。5、專一性要求不高的定量PCR檢測。Real-time PCR探針法普遍用于人類傳染病的診斷和病原定量。廣州微量Real-time PCR服務(wù)聚合酶鏈...

Real-time PCR的染料法和探針法的選擇：進行mRNA表達量的測定，采用染料法是比較經(jīng)濟實惠的；染料法可以通過比較熔解曲線的熔解峰位置得到產(chǎn)物特異性的情況；目的基因和內(nèi)參基因分管檢測，染料法可以選用Realtime染料PCRPreMIX，探針法主要應(yīng)用于病毒RNA的檢測；以及單位點突變（SNP）；多基因的合并檢測，探針法還可用于同一個反應(yīng)中同時檢測目的基因和內(nèi)參基因的情況；而染料法則必須分管檢測。Real-time PCR：實時熒光定量PCR技術(shù)（Real-timequantitativePolymeraseChainReaction簡稱Real-time PCR）是在定性PCR技術(shù)基...

Real-time PCR從用途上分可以分為定性分析和定量分析：定量分析可以分為定量和相對定量兩種。定量指的是我們想知道某個基因在初始樣品中具體的拷貝數(shù)或濃度是多少？定量實驗必須使用已知拷貝數(shù)的標準品，必須做標準曲線。而相對定量是指我們想知道某一個基因在不同樣品中表達量的差異，其目的是測定目的基因在兩個或多個樣本中的含量的相對比例，而不需要知道它們在每個樣本中的拷貝數(shù)。舉例來說，如研究項目中包括使用高鹽脅迫處理的樣本和未高鹽脅迫處理的樣本，記為已處理樣本和未處理樣本，通?？梢詫⑽刺幚順颖局付榛鶞剩?guī)定其目的基因濃度為100%，用已處理樣本的定量結(jié)果除以未處理樣本的定量結(jié)果，就可以計算每個已處...

Real-time PCR原理：Real-time PCR主要指在PCR反應(yīng)體系中加入熒光物質(zhì)，然后通過熒光化學(xué)物質(zhì)監(jiān)測每次PCR反應(yīng)循環(huán)后產(chǎn)物總量的方法，之后通過內(nèi)參法或外參法對待測樣品中的特定DNA序列（目的基因）進行定量分析的方法。實驗過程中，這些熒光物質(zhì)可以在激發(fā)光的作用下釋放出一定波長的發(fā)射光，定量用PCR儀通過對這些發(fā)射光進行實時監(jiān)測，較終可以描繪出整個PCR的反應(yīng)過程，這就是Real-time PCR的原理。Real-time PCR鏈式反應(yīng)：DNA的半保留復(fù)制是生物進化和傳代的重要途徑。雙鏈DNA在多種酶的作用下可以變性解旋成單鏈，在DNA聚合酶的參與下，根據(jù)堿基互補配對原則復(fù)...

引物的設(shè)計注意事項：1，引物設(shè)計要跨內(nèi)含子，不能在一個外顯子上（我們的實驗是以cDNA為模板來擴增的，如果有DNA污染的話，因為DNA上含有分子量很大的內(nèi)含子，不可能完成擴增。這對我們消除整個實驗的誤差起很大的作用）。2，引物設(shè)計的時候要盡可能設(shè)計在同一退火溫度，方便于以后同時擴增很多不同的基因片段。但是如果相差比較大，就得分開做，浪費模板，浪費管家基因，所以每個實驗室設(shè)計引物的時候要盡可能一致，這樣就不用每次查退火溫度，且對整個實驗有利。許多疾病的未知病因的測序正在通過聚合酶鏈反應(yīng)得到解決。南通組織熒光定量PCR研究方案Real-time PCR雙熒光標記探針設(shè)計原則：具體的其他要求可以具體...

Real-time PCR-傳統(tǒng)定量PCR：1）內(nèi)參照法：在不同的PCR反應(yīng)管中加入已定量的內(nèi)標和引物，內(nèi)標用基因工程方法合成。上游引物用熒光標記，下游引物不標記。在模板擴增的同時，內(nèi)標也被擴增。在PCR產(chǎn)物中，由于內(nèi)標與靶模板的長度不同，二者的擴增產(chǎn)物可用電泳或高效液相分離開來，分別測定其熒光強度，以內(nèi)標為對照定量待檢測模板。2）競爭法：選擇由突變克隆產(chǎn)生的含有一個新內(nèi)切位點的外源競爭性模板。在同一反應(yīng)管中，待測樣品與競爭模板用同一對引物同時擴增（其中一個引物為熒光標記）。定量聚合酶鏈反應(yīng)或者實時聚合酶鏈反應(yīng)不要與逆轉(zhuǎn)錄允許估計樣品中存在的給定序列的量。無錫血液Real-time PCR設(shè)計...

Real-time PCR鏈式反應(yīng)的常見問題：靶序列變異：如靶序列發(fā)生突變或缺失，影響引物與模板特異性結(jié)合，或因靶序列某段缺失使引物與模板失去互補序列，其PCR擴增是不會成功的。假陽性：出現(xiàn)的PCR擴增條帶與目的靶序列條帶一致，有時其條帶更整齊，亮度更高。引物設(shè)計不合適：選擇的擴增序列與非目的擴增序列有同源性，因而在進行PCR擴增時，擴增出的PCR產(chǎn)物為非目的性的序列。靶序列太短或引物太短，容易出現(xiàn)假陽性。需重新設(shè)計引物。出現(xiàn)片狀拖帶或涂抹帶：PCR擴增有時出現(xiàn)涂抹帶或片狀帶或地毯樣帶。其原因往往由于酶量過多或酶的質(zhì)量差，dNTP濃度過高，Mg2+濃度過高，退火溫度過低，循環(huán)次數(shù)過多引起。其對...

Real-time PCR從用途上分可以分為定性分析和定量分析：定性分析指的是用于分析待檢測的樣本中是否存在我們想要檢測的成分，即待檢測成分有無的分析。通常，定性分析可以應(yīng)用于病毒以及病原菌的檢測，物種鑒定以及基因分型等。病毒及病原菌檢測，如SARS、H1N1病毒，都可以通過Real-time PCR的方法進行高靈敏度的檢測，定性分析樣本是否已被病毒傳播。物種鑒定如我們國家的一些檢驗檢疫機構(gòu)，想要檢測進口的牛肉制品中是否含有雞源、豬源或鴨源等成分，或者用于檢測羊奶中是否會摻有牛奶等等，可以通過Real-time PCR的方法進行檢測?；蚍中?，如啤酒型，肥胖型基因的檢測，就是Real-time...

Real-time PCR鏈式反應(yīng)：每次循環(huán)都得加入新的DNA聚合酶，不但操作煩瑣，而且價格昂貴，制約了PCR技術(shù)的應(yīng)用和發(fā)展。耐熱DNA聚合酶-Taq酶的發(fā)現(xiàn)對于PCR的應(yīng)用有里程碑的意義，該酶可以耐受90℃以上的高溫而不失活，不需要每個循環(huán)加酶，使PCR技術(shù)變得非常簡捷、同時也降低了成本，PCR技術(shù)得以大量應(yīng)用，并逐步應(yīng)用于臨床。多重連接依賴探針擴增允許用單個引物對擴增多個靶標，從而避免多重PCR的分辨率限制。引物的設(shè)計注意事項：1，注意引物設(shè)計好后的產(chǎn)物長度。Real-time PCR的較佳產(chǎn)物長度在150-250kb左右（書上說這樣可以增加熒光的敏感度，減少實驗誤差，但是我對這個說法持...

內(nèi)標在傳統(tǒng)定量中的作用，由于傳統(tǒng)定量方法都是終點檢測，即PCR到達平臺期后進行檢測，而PCR經(jīng)過對數(shù)期擴增到達平臺期時，檢測重現(xiàn)性極差。同一個模板在96孔PCR儀上做96次重復(fù)實驗，所得結(jié)果有很大差異，因此無法直接從終點產(chǎn)物量推算出起始模板量。加入內(nèi)標后，可部分消除終產(chǎn)物定量所造成的不準確性。但即使如此，傳統(tǒng)的定量方法也都只能算作半定量、粗略定量的方法。內(nèi)標對定量PCR的影響，若在待測樣品中加入已知起始拷貝數(shù)的內(nèi)標，則PCR反應(yīng)變?yōu)殡p重PCR，雙重PCR反應(yīng)中存在兩種模板之間的干擾和競爭，尤其當兩種模板的起始拷貝數(shù)相差比較大時，這種競爭會表現(xiàn)得更為明顯。但由于待測樣品的起始拷貝數(shù)是未知的，所以...

Real-time PCR操作流程：1、收集樣品。2相關(guān)試劑總RNA提取試劑TREzolReagent(RNA提取試劑),M-MLV（cDNA逆轉(zhuǎn)錄酶）,RNA純化試劑,RealqPCRMasterMix（螢光定量PCR預(yù)混試劑）。3實驗儀器螢光定量PCR儀;PCR儀；低溫離心機。4總RNA提取。5cDNA合成在0.5ml的離心管中加入1µl模板總RNA（1µg/µl）；Real-time PCR操作流程：2µl隨機引物（T18,10pmol/ul）；2µl10mMdNTPmix；加水至15µl體系?；靹蚝?0℃變性RNA...

Real-time PCR原理：基于探針的化學(xué)法，Real-time PCR應(yīng)用一個或多個熒光標記的寡核苷酸探針檢測PCR擴增產(chǎn)物；依賴熒光能量共振傳遞（FRET）檢測特異性擴增產(chǎn)物，單單檢測特異性擴增產(chǎn)物，DNA及RNA定量；基因表達驗證；等位基因鑒別；SNP分型；病原體和病毒檢測；多重PCR，探針和目標片段的特異性結(jié)合產(chǎn)生熒光信號，因此減少了背景熒光和假陽性；探針可標記不同波長的熒光基團，用于多重PCR反應(yīng)。對于不同的靶序列需要合成不同的探針，原料成本較高。許多疾病的未知病因的測序正在通過聚合酶鏈反應(yīng)得到解決。武漢細胞數(shù)字PCR服務(wù)所謂real-timeQ-PCR技術(shù)，是指在PCR反應(yīng)體系...

Real-time PCR：Ct值與起始模板的線性關(guān)系由于Ct值與起始模板的對數(shù)存在線性關(guān)系，可利用標準曲線對未知樣品進行定量測定，因此，實時熒光定量PCR是一種采用外標準曲線定量的方法。外標準曲線的定量方法相比內(nèi)標法是一種準確的、值得信賴的科學(xué)方法。利用外標準曲線的實時熒光定量PCR是迄今為止定量較準確，重現(xiàn)性較好的定量方法，已得到全世界的公認，普遍用于基因表達研究、轉(zhuǎn)基因研究，藥物療效考核、病原體檢測等諸多領(lǐng)域。實時熒光定量PCR的定量方法，在Real-time PCR中，模板定量有兩種策略，相對定量和定量。PCR可能是分子生物學(xué)中使用很較廣的技術(shù)。臺州組織定量PCR聚合酶鏈式反應(yīng)的試驗污...

Real-time PCR實驗注意事項-防止RNA酶污染的措施：1.所有的玻璃器皿均應(yīng)在使用前于180℃的高溫下干烤6hr或更長時間。2.塑料器皿可用0.1%DEPC水浸泡或用氯仿沖洗（注意：有機玻璃器具因可被氯仿腐蝕，故不能使用）。3.有機玻璃的電泳槽等，可先用去污劑洗滌，雙蒸水沖洗，乙醇干燥，再浸泡在3%H2O2室溫10min，然后用0.1%DEPC水沖洗，晾干。4.配制的溶液應(yīng)盡可能的用0.1%DEPC，在37℃處理12hr以上。然后用高壓滅菌除去殘留的DEPC。不能高壓滅菌的試劑，應(yīng)當用DEPC處理過的無菌雙蒸水配制，然后經(jīng)0.22μm濾膜過濾除菌。5.操作人員戴一次性口罩、帽子、手套...

Real-time PCR：使用Real-time PCR進行基因檢測,被普遍應(yīng)用于病毒和病原菌檢測、轉(zhuǎn)基因食品檢測、遺傳病基因檢測等領(lǐng)域。一般首先需要利用專業(yè)使用的試劑盒從待檢樣品中提取其核酸（DNAorRNA），并經(jīng)過精制等復(fù)雜的操作（通常稱為前處理操作）之后才可以進行Real-time PCR。不易受反應(yīng)阻害物的影響，使用時不需要進行復(fù)雜的前處理操作，單單需將待檢樣品直接加入到檢測試劑中即可開始檢測。通過使用本產(chǎn)品，可以在更短的時間內(nèi)，簡便、低成本地進行Real-time PCR檢測。實時定量PCR通用電腦，自動分析軟件等構(gòu)成。寧波組織定量PCR原理Real-time PCR從用途上分可...

Real-time PCR原理：Real-time PCR主要指在PCR反應(yīng)體系中加入熒光物質(zhì)，然后通過熒光化學(xué)物質(zhì)監(jiān)測每次PCR反應(yīng)循環(huán)后產(chǎn)物總量的方法，之后通過內(nèi)參法或外參法對待測樣品中的特定DNA序列（目的基因）進行定量分析的方法。實驗過程中，這些熒光物質(zhì)可以在激發(fā)光的作用下釋放出一定波長的發(fā)射光，定量用PCR儀通過對這些發(fā)射光進行實時監(jiān)測，較終可以描繪出整個PCR的反應(yīng)過程，這就是Real-time PCR的原理。Real-time PCR鏈式反應(yīng)：DNA的半保留復(fù)制是生物進化和傳代的重要途徑。雙鏈DNA在多種酶的作用下可以變性解旋成單鏈，在DNA聚合酶的參與下，根據(jù)堿基互補配對原則復(fù)...

所謂real-timeQ-PCR技術(shù)，是指在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基因，利用熒光信號累積實時監(jiān)測整個PCR進程，之后通過標準曲線對未知模板進行定量分析的方法。在real-time技術(shù)的發(fā)展過程中，兩個重要的發(fā)現(xiàn)起著關(guān)鍵的作用：（1）TaqDNA多聚酶的5′核酸外切酶活性的發(fā)現(xiàn)，它能降解特異性熒光記探針，因此使得間接的檢測PCR產(chǎn)物成為可能。（2）此后熒光雙標記探針的運用使在一密閉的反應(yīng)管中能實時地監(jiān)測反應(yīng)全過程。這兩個發(fā)現(xiàn)的結(jié)合以及相應(yīng)的儀器和試劑的商品化發(fā)展導(dǎo)致real-timeQ-PCR方法在研究工作中的運用?；谔结樀幕瘜W(xué)法，Real-time PCR應(yīng)用一個或多個熒光標記的寡核苷酸探...

Real-time PCR鏈式反應(yīng)的特點：靈敏度高：PCR產(chǎn)物的生成量是以指數(shù)方式增加的，能將皮克(pg=10-12）量級的起始待測模板擴增到微克（μg=-6）水平。能從100萬個細胞中檢出一個靶細胞；在病毒的檢測中，PCR的靈敏度可達3個RFU(空斑形成單位）；在細菌學(xué)中很小檢出率為3個細菌。簡便、快速：PCR反應(yīng)用耐高溫的TaqDNA聚合酶，一次性地將反應(yīng)液加好后，即在DNA擴增液和水浴鍋上進行變性-退火-延伸反應(yīng)，一般在2～4小時完成擴增反應(yīng)。擴增產(chǎn)物一般用電泳分析，不一定要用同位素，無放射性污染、易推廣。純度要求低：不需要分離病毒或細菌及培養(yǎng)細胞，DNA粗制品及RNA均可作為擴增模板。...

Real-time PCR-傳統(tǒng)定量PCR：擴增后用內(nèi)切酶消化PCR產(chǎn)物，競爭性模板的產(chǎn)物被酶解為兩個片段，而待測模板不被酶切，可通過電泳或高效液相將兩種產(chǎn)物分開，分別測定熒光強度，根據(jù)已知模板推測未知模板的起始拷貝數(shù)。PCR－ELISA法：利用地高辛或生物素等標記引物，擴增產(chǎn)物被固相板上特異的探針所結(jié)合，再加入抗地高辛或生物素酶標抗體－辣根過氧化物酶結(jié)合物，之后酶使底物顯色。常規(guī)的PCR－ELISA法只是定性實驗，若加入內(nèi)標，作出標準曲線，也可實現(xiàn)定量檢測目的。聚合酶鏈反應(yīng)五要素：參加PCR反應(yīng)的物質(zhì)主要有五種即：引物、酶、dNTP、模板和緩沖液。麗水特殊樣本定量PCRReal-time P...

聚合酶鏈式反應(yīng)又稱多聚酶鏈式反應(yīng)，是一項利用DNA雙鏈復(fù)制的原理，在生物體外復(fù)制特定DN段的核酸合成技術(shù)。透過這項技術(shù)，可在短時間內(nèi)大量擴增目的基因，而不必依賴大腸桿菌或酵母菌等生物體。聚合酶鏈反應(yīng)是是一種簡單，廉價和可靠的方法復(fù)制DN段，這個概念適用于現(xiàn)物學(xué)和相關(guān)科學(xué)的許多領(lǐng)域。PCR可能是分子生物學(xué)中使用很較廣的技術(shù)。這種技術(shù)被用于生物醫(yī)學(xué)研究，犯罪取證和分子考古學(xué)。通常，PCR由一系列20-40次重復(fù)的溫度變化組成，稱為熱循環(huán)，每個循環(huán)通常由兩個或三個離散的溫度步驟組成。聚合酶鏈式反應(yīng)準備：引物內(nèi)部不應(yīng)出現(xiàn)互補序列。聚合酶鏈式反應(yīng)準備：引物內(nèi)部不應(yīng)出現(xiàn)互補序列。溫州血液RT-PCR檢測技...

引物的設(shè)計對于這個實驗至關(guān)重要，因為Real-time PCR的檢測靈敏度比較高，所以相應(yīng)的對引物設(shè)計的要求就很高。普通的要求規(guī)則大家都知道，還有幾點必須注意：1，引物的錯配率（引物錯配形成引物二聚體，但是SYBR照樣能嵌入進去，結(jié)果導(dǎo)致實驗結(jié)果的誤差很大，重復(fù)性也不好）。2，引物的特異性一定要高（不像常規(guī)PCR，引物同源性不高，只要兩條產(chǎn)物的片段長度相差足夠大，在電泳的時候能夠區(qū)分開就可以。Real-time PCR只有在熔解曲線的時候能分開，所以這就造成整個實驗結(jié)果誤差很大，不可信）。實時熒光定量PCR技術(shù)有效地解決了傳統(tǒng)定量只能終點檢測的局限。南京微量數(shù)字PCR原理Real-time P...

Real-time PCR實驗注意事項-防止RNA酶污染的措施：1.所有的玻璃器皿均應(yīng)在使用前于180℃的高溫下干烤6hr或更長時間。2.塑料器皿可用0.1%DEPC水浸泡或用氯仿沖洗（注意：有機玻璃器具因可被氯仿腐蝕，故不能使用）。3.有機玻璃的電泳槽等，可先用去污劑洗滌，雙蒸水沖洗，乙醇干燥，再浸泡在3%H2O2室溫10min，然后用0.1%DEPC水沖洗，晾干。4.配制的溶液應(yīng)盡可能的用0.1%DEPC，在37℃處理12hr以上。然后用高壓滅菌除去殘留的DEPC。不能高壓滅菌的試劑，應(yīng)當用DEPC處理過的無菌雙蒸水配制，然后經(jīng)0.22μm濾膜過濾除菌。5.操作人員戴一次性口罩、帽子、手套...

Real-timePCR技術(shù)服務(wù)聚合酶鏈式反應(yīng)的試驗污染：實驗室中克隆質(zhì)粒的污染：在分子生物學(xué)實驗室及某些用克隆質(zhì)粒做陽性對照的檢驗室，這個問題也比較常見。因為克隆質(zhì)粒在單位容積內(nèi)含量相當高，另外在純化過程中需用較多的用具及試劑，而且在活細胞內(nèi)的質(zhì)粒，由于活細胞的生長繁殖的簡便性及具有很強的生命力。其污染可能性也很大。污染的監(jiān)測：一個好的實驗室，要時刻注意污染的監(jiān)測，考慮有無污染是什么原因造成的污染，以便采取措施，防止和消除污染。重復(fù)性試驗。選擇不同區(qū)域的引物進行PCR擴增。Real-time PCR反是一項利用DNA雙鏈復(fù)制的原理。上海實時熒光定量PCRReal-time PCR原理：所謂實...

實時熒光定量PCR：實時熒光定量PCR技術(shù)有效地解決了傳統(tǒng)定量只能終點檢測的局限，實現(xiàn)了每一輪循環(huán)均檢測一次熒光信號的強度，并記錄在電腦軟件之中，通過對每個樣品Ct值的計算，根據(jù)標準曲線獲得定量結(jié)果。因此，實時熒光定量PCR無需內(nèi)標是建立在兩個基礎(chǔ)之上的：Ct值的重現(xiàn)性PCR循環(huán)在到達Ct值所在的循環(huán)數(shù)時，剛剛進入真正的指數(shù)擴增期（對數(shù)期），此時微小誤差尚未放大，因此Ct值的重現(xiàn)性極好，即同一模板不同時間擴增或同一時間不同管內(nèi)擴增，得到的Ct值是恒定的。Real-time PCR包括病原微生物或病毒含量的檢測。常州特殊樣本定量PCR哪家好Real-time PCR與普通PCR的實驗?zāi)康牟煌?..

Real-time PCR雙熒光標記探針設(shè)計原則：具體的其他要求可以具體聯(lián)系設(shè)計公司，拿到合成好的引物，需要先確認引物的性能?？梢杂眠@對引物先擴增梯度稀釋后的標準品（標準品介紹見后續(xù)內(nèi)容）。由不同梯度標準品的加量和其對應(yīng)的Ct值，描繪出一條標準曲線。這里要注意根據(jù)標準曲線得到的參數(shù)是非常重要的。引物性能確認：1.決定系數(shù)R2大于0.98，越接近于1，結(jié)果越可靠。2.擴增效率一般要求在0.8-1.2，越接近于1，越好。3.檢測的靈敏度，必須確認，通常要求35個循環(huán)以內(nèi)，一般可以得到比較好的定量結(jié)果，30個循環(huán)以內(nèi)，沒有非特異性擴增產(chǎn)生。4.NTC是必須要確認的，通常要求30個循環(huán)內(nèi)沒有引物二聚體...

引物的設(shè)計對于這個實驗至關(guān)重要，因為Real-time PCR的檢測靈敏度比較高，所以相應(yīng)的對引物設(shè)計的要求就很高。普通的要求規(guī)則大家都知道，還有幾點必須注意：1，引物的錯配率（引物錯配形成引物二聚體，但是SYBR照樣能嵌入進去，結(jié)果導(dǎo)致實驗結(jié)果的誤差很大，重復(fù)性也不好）。2，引物的特異性一定要高（不像常規(guī)PCR，引物同源性不高，只要兩條產(chǎn)物的片段長度相差足夠大，在電泳的時候能夠區(qū)分開就可以。Real-time PCR只有在熔解曲線的時候能分開，所以這就造成整個實驗結(jié)果誤差很大，不可信）。定量聚合酶鏈反應(yīng)或者實時聚合酶鏈反應(yīng)不要與逆轉(zhuǎn)錄允許估計樣品中存在的給定序列的量。蘇州血液RT-PCR檢測...

Real-time PCR鏈反應(yīng)注意事項：在實驗過程中要防止RNA的降解，保持RNA的完整性。在總RNA的提取過程中，注意避免mRNA的斷裂；為了防止非特異性擴增，必須設(shè)陰性對照；內(nèi)參的設(shè)定：主要為了用于靶RNA的定量。常用的內(nèi)參有G3PD（甘油醛-3-磷酸脫氫酶）、β-Actin（β-肌動蛋白）等。其目的在于避免RNA定量誤差、加樣誤差以及各PCR反應(yīng)體系中擴增效率不均一各孔間的溫度差等所造成的誤差；PCR不能進入平臺期，出現(xiàn)平臺效應(yīng)與所擴增的目的基因的長度、序列、二級結(jié)構(gòu)以及目標DNA起始的數(shù)量有關(guān)。故對于每一個目標序列出現(xiàn)平臺效應(yīng)的循環(huán)數(shù)，均應(yīng)通過單獨實驗來確定；防止DNA的污染：采用D...

所謂real-timeQ-PCR技術(shù)，是指在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基因，利用熒光信號累積實時監(jiān)測整個PCR進程，之后通過標準曲線對未知模板進行定量分析的方法。在real-time技術(shù)的發(fā)展過程中，兩個重要的發(fā)現(xiàn)起著關(guān)鍵的作用：（1）TaqDNA多聚酶的5′核酸外切酶活性的發(fā)現(xiàn)，它能降解特異性熒光記探針，因此使得間接的檢測PCR產(chǎn)物成為可能。（2）此后熒光雙標記探針的運用使在一密閉的反應(yīng)管中能實時地監(jiān)測反應(yīng)全過程。這兩個發(fā)現(xiàn)的結(jié)合以及相應(yīng)的儀器和試劑的商品化發(fā)展導(dǎo)致real-timeQ-PCR方法在研究工作中的運用。所謂實時熒光定量PCR技術(shù)，是指在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團。南通骨頭PCR...