Real-time PCR-傳統(tǒng)定量PCR：1）內參照法：在不同的PCR反應管中加入已定量的內標和引物，內標用基因工程方法合成。上游引物用熒光標記，下游引物不標記。在模板擴增的同時，內標也被擴增。在PCR產物中，由于內標與靶模板的長度不同，二者的擴增產物可用電泳或高效液相分離開來，分別測定其熒光強度，以內標為對照定量待檢測模板。2）競爭法：選擇由突變克隆產生的含有一個新內切位點的外源競爭性模板。在同一反應管中，待測樣品與競爭模板用同一對引物同時擴增（其中一個引物為熒光標記）。定量聚合酶鏈反應或者實時聚合酶鏈反應不要與逆轉錄允許估計樣品中存在的給定序列的量。無錫血液Real-time PCR設計公司

Real-time PCR與普通PCR的實驗目的不同，所以對引物的設計要求也不同。普通PCR的實驗目的只是為了獲得目的基因產物，允許有非特異擴增，只要目標條帶清晰明亮，就可以通過切膠回收的方法回收目標條帶，之后進行后續(xù)的克隆、測序。但Real-time PCR的目的是為了讓目的基因按照理論值或是按照接近理論值進行擴增，只有這樣的擴增后續(xù)由Ct值推算出的起始量模板量才準確，基于此，Real-time PCR對非特異性擴增和引物二聚體的存在有較嚴格的要求。廣州血液數字PCR研究方案所謂Real-time PCR技術，是指在PCR反應體系中加入螢光基團。

Real-time PCR相對定量中的標準曲線法如何進行：主要是相對定量標準品的制作，一般有三種方法：1、比較復雜的方法：質粒，采用Biotnt提供內參基因的特異性Real-time PCRmRNA引物，對目的基因進行Real-time PCR實驗，得到PCR擴增產物；PCR擴增產物轉入質粒中，得到相對定量的標準品；2、一般采用的方法1：比較強的CDNA模板，3、一般采用的方法：PCR擴增產物，如果在方法2中找不到比較強的CDNA模板，則選用PCR產物作為相對定量的標準品也是可以的；需要注意的事項是：PCR產物濃度很高，而Real-time PCR的產物片段比較短，容易在稀釋的過程中造成PCR污染，要注意操作。

聚合酶鏈式反應又稱多聚酶鏈式反應，是一項利用DNA雙鏈復制的原理，在生物體外復制特定DN段的核酸合成技術。透過這項技術，可在短時間內大量擴增目的基因，而不必依賴大腸桿菌或酵母菌等生物體。聚合酶鏈反應是是一種簡單，廉價和可靠的方法復制DN段，這個概念適用于現(xiàn)物學和相關科學的許多領域。PCR可能是分子生物學中使用很較廣的技術。這種技術被用于生物醫(yī)學研究，犯罪取證和分子考古學。通常，PCR由一系列20-40次重復的溫度變化組成，稱為熱循環(huán)，每個循環(huán)通常由兩個或三個離散的溫度步驟組成。聚合酶鏈式反應準備：引物內部不應出現(xiàn)互補序列。在不同的PCR反應管中加入已定量的內標和引物，內標用基因工程方法合成。

Real-time PCR：實時熒光定量PCR是目前確定樣品中DNA(或cDNA)拷貝數較敏感、較準確的方法。如果用于RNA檢測，這被稱為逆轉錄實時PCR即（Real-timeRT-PCR）是實時PCR法，它是指對DNA或經過反轉入（RT-PCR）的RNA通過聚合酶鏈式反應并實時監(jiān)測DNA的放大過程，在擴增的指數增長期就測量擴增產物，因為擴增指數增長期測量值與特異DNA（RNA）起始量存在相關性，從而實現(xiàn)定量檢測。Real-time PCR的基本目標是精確測量和鑒別非常微量的特異性核酸，從而可通過監(jiān)測CT值而實現(xiàn)對原始目標基因的含量定量。實時熒光定量PCR法較大的優(yōu)點是克服了終點PCR法進入平臺期或叫飽和期后定量的較大誤差，實現(xiàn)DNA/RNA的精確定量。該技術不單單實現(xiàn)了對DNA/RNA模板的定量，而且具有靈敏度和特異性高、能實現(xiàn)多重反應、自動化程度高、無污染、實時和準確等特點，該技術在醫(yī)學臨床檢驗及臨床醫(yī)學研究方面有著重要的意義。聚合酶鏈式反應又稱多聚酶鏈式反應。徐州骨頭RT-PCR檢測技術方案

由于在PCR擴增的指數時期，模板的Ct值和該模板的起始拷貝數存在線性關系，所以成為定量的依據。無錫血液Real-time PCR設計公司

內標在傳統(tǒng)定量中的作用，由于傳統(tǒng)定量方法都是終點檢測，即PCR到達平臺期后進行檢測，而PCR經過對數期擴增到達平臺期時，檢測重現(xiàn)性極差。同一個模板在96孔PCR儀上做96次重復實驗，所得結果有很大差異，因此無法直接從終點產物量推算出起始模板量。加入內標后，可部分消除終產物定量所造成的不準確性。但即使如此，傳統(tǒng)的定量方法也都只能算作半定量、粗略定量的方法。內標對定量PCR的影響，若在待測樣品中加入已知起始拷貝數的內標，則PCR反應變?yōu)殡p重PCR，雙重PCR反應中存在兩種模板之間的干擾和競爭，尤其當兩種模板的起始拷貝數相差比較大時，這種競爭會表現(xiàn)得更為明顯。但由于待測樣品的起始拷貝數是未知的，所以無法加入合適數量的已知模板作為內標。也正是這個原因，傳統(tǒng)定量方法雖然加入內標，但仍然只是一種半定量的方法。無錫血液Real-time PCR設計公司

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