Real-time PCR螢光染料摻入法:在PCR反應體系中，加入過量SYBR螢光染料，SYBR螢光染料特異性地摻入DNA雙鏈后，發(fā)射螢光信號，而不摻入鏈中的SYBR染料分子不會發(fā)射任何螢光信號，從而保證螢光信號的增加與PCR產(chǎn)物的增加完全同步。此方法適用于：1、靈敏度高：使用SYBR可使螢光效果增強到1000倍以上。2、通用性好,不需要設計探針,方法簡便,省時,價格低廉。3、通用型方法，在國內(nèi)外科研中普遍使用。4、高通量大規(guī)模的定量PCR檢測。5、專一性要求不高的定量PCR檢測。Real-time PCR探針法普遍用于人類傳染病的診斷和病原定量。廣州微量Real-time PCR服務

聚合酶鏈式反應又稱多聚酶鏈式反應，是一項利用DNA雙鏈復制的原理，在生物體外復制特定DN段的核酸合成技術。透過這項技術，可在短時間內(nèi)大量擴增目的基因，而不必依賴大腸桿菌或酵母菌等生物體。聚合酶鏈反應是是一種簡單，廉價和可靠的方法復制DN段，這個概念適用于現(xiàn)物學和相關科學的許多領域。PCR可能是分子生物學中使用很較廣的技術。這種技術被用于生物醫(yī)學研究，犯罪取證和分子考古學。通常，PCR由一系列20-40次重復的溫度變化組成，稱為熱循環(huán)，每個循環(huán)通常由兩個或三個離散的溫度步驟組成。聚合酶鏈式反應準備：引物內(nèi)部不應出現(xiàn)互補序列。無錫特殊樣本定量PCR實時熒光定量PCR技術有效地解決了傳統(tǒng)定量只能終點檢測的局限。

聚合酶鏈式反應準備：PCR引物設計，PCR反應中有兩條引物，即5′端引物和3′引物。設計引物時以一條DNA單鏈為基準（常以信息鏈為基準），5′端引物與位于待擴增片段5′端上的一小段DNA序列相同；3′端引物與位于待擴增片段3′端的一小段DNA序列互補。引物設計的基本原則：引物長度：15-30bp，常用為20bp左右。引物堿基：G+C含量以40-60%為宜，G+C太少擴增效果不佳，G+C過多易出現(xiàn)非特異條帶。ATGC很好隨機分布，避免5個以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列參照。

Real-time PCR：1.DNA或RNA的定量分析：Real-time PCR包括病原微生物或病毒含量的檢測,轉(zhuǎn)基因動植物轉(zhuǎn)基因拷貝數(shù)的檢測，RNAi基因失活率的檢測等；2.基因表達差異分析：例如比較經(jīng)過不同處理樣本之間特定基因的表達差異(如藥物處理、物理處理、化學處理等)，特定基因在不同時相的表達差異以及cDNA晶片或差顯結(jié)果的確證；3.基因分型：例如SNP檢測，甲基化檢測等。Real-time PCR常用的兩種方法分別為Sybrgreen（螢光染料摻入法）和Taqmanprobe（探針法）。聚合酶鏈反應是是一種簡單，廉價和可靠的方法復制DN段。

Real-time PCR：基線（baseline)：通常是3－15個循環(huán)的熒光信號，同一次反應中針對不同的基因需單獨設置基線。閾值（threshold)：自動設置是3-15個循環(huán)的熒光信號的標準偏差的10倍。手動設置：置于指數(shù)擴增期，剛好可以清楚地看到熒光信號明顯增強。同一次反應中針對不同的基因可單獨設置閾值，但對于同一個基因擴增一定要用同一個閾值。Ct值：與起始濃度的對數(shù)成線性關系，分析定量時候一般取Ct:15-35.太大或者太小都會導致定量的不準確。相對定量：通過與內(nèi)參基因Ct值之間的相差來計算基因之間的表達差異,一般是2-△△Ct?；蛘呤强紤]擴增效率的Pfaffl法。因為Real-time PCR的檢測靈敏度比較高，所以相應的對引物設計的要求就很高。徐州分子生物學PCR檢測技術

Real-time PCR探針法具有高適應性和可靠性。廣州微量Real-time PCR服務

Real-time PCR原理：Real-time PCR主要指在PCR反應體系中加入熒光物質(zhì)，然后通過熒光化學物質(zhì)監(jiān)測每次PCR反應循環(huán)后產(chǎn)物總量的方法，之后通過內(nèi)參法或外參法對待測樣品中的特定DNA序列（目的基因）進行定量分析的方法。實驗過程中，這些熒光物質(zhì)可以在激發(fā)光的作用下釋放出一定波長的發(fā)射光，定量用PCR儀通過對這些發(fā)射光進行實時監(jiān)測，較終可以描繪出整個PCR的反應過程，這就是Real-time PCR的原理。Real-time PCR鏈式反應：DNA的半保留復制是生物進化和傳代的重要途徑。雙鏈DNA在多種酶的作用下可以變性解旋成單鏈，在DNA聚合酶的參與下，根據(jù)堿基互補配對原則復制成同樣的兩分子拷貝。在實驗中發(fā)現(xiàn)，DNA在高溫時也可以發(fā)生變性解鏈，當溫度降低后又可以復性成為雙鏈。因此，通過溫度變化控制DNA的變性和復性，加入設計引物，DNA聚合酶、dNTP就可以完成特定基因的體外復制。但是，DNA聚合酶在高溫時會失活。廣州微量Real-time PCR服務

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