真核生物的基因組 DNA 以染色質(zhì)(Chromatin)的形式存在。因此,研究蛋白質(zhì)與 DNA 在染色質(zhì)環(huán)境中的相互作用是闡明真核生物基因表達(dá)機(jī)制的基本途徑,而染色質(zhì)免疫共沉淀(Chromatinimmunoprecipitation,ChIP)技術(shù)是目前公認(rèn)的研究此相互作用的選擇,是真核生物基因表達(dá)機(jī)制研究中不可或缺的技術(shù)之一。
它的基本原理是在活細(xì)胞狀態(tài)下,固定蛋白質(zhì)-DNA(染色質(zhì))復(fù)合物,并將其切斷為一定長度范圍內(nèi)的染色質(zhì)小片段,然后通過免疫學(xué)方法(抗體親和)沉淀此復(fù)合體,特異性地富集目的蛋白結(jié)合的 DNA,通過對目的片段的純化與后期檢測,從而獲得蛋白質(zhì)與 DNA 相互作用的信息。
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免疫沉淀技術(shù)(Immunoprecipitation,簡稱IP)是一種生物化學(xué)方法,它利用特異性抗體對抗原進(jìn)行親和純化。在含有目的抗原的細(xì)胞裂解液中加入特定的抗體以及Protein A/G-Beads(預(yù)先將Protein A/G固定結(jié)合在磁珠上),根據(jù)抗原與抗體、Protein A/G與抗體的Fc的特異性,形成“抗原-抗體-Protein A/G-Beads”復(fù)合物,清洗離心后去除溶液中未結(jié)合的雜蛋白,檢測是否存在目的蛋白。
免疫沉淀技術(shù)常用于從細(xì)胞或組織裂解物中分離用于免疫印跡檢測或其他檢測技術(shù)的蛋白和其他生物分子。它的目標(biāo)是分離足夠用于Western Blot或其他檢測方法檢測的蛋白質(zhì)。
上海ChIP免疫沉淀磁珠原理免疫沉淀技術(shù)Co-IP的優(yōu)缺點是什么?
免疫沉淀(IP)實驗中抗體的選擇非常關(guān)鍵,因為抗體的特異性和親和力直接影響到實驗的成功與否。
1. 特異性:抗體應(yīng)當(dāng)對目標(biāo)蛋白具有高度的特異性,以避免與其他蛋白發(fā)生非特異性結(jié)合,導(dǎo)致假陽性結(jié)果。
2. 親和力:抗體對目標(biāo)蛋白的親和力要足夠高,以確保在免疫沉淀過程中能夠有效地捕獲目標(biāo)蛋白。
3. 抗體類型:單克隆抗體和多克隆抗體都可以用于IP實驗。單克隆抗體提供更高的特異性和批間一致性,而多克隆抗體可能提供更強(qiáng)的結(jié)合能力和更廣的表位覆蓋。
4. 應(yīng)用驗證:選擇已經(jīng)過免疫沉淀(IP)或相關(guān)應(yīng)用(如Western blot, IHC)驗證的抗體,這增加了實驗成功的可能性。
5. 供應(yīng)商信息:選擇信譽良好的抗體供應(yīng)商,并查看供應(yīng)商提供的技術(shù)數(shù)據(jù)和客戶評價,以幫助做出決策。
免疫共沉淀分析(Co-IP)與IP十分類似,基本的技術(shù)都是采用目標(biāo)抗原特異性的固相化抗體;但I(xiàn)P的目標(biāo)是純化單一抗原,而Co-IP旨在分離抗原及與抗原結(jié)合的蛋白質(zhì)或配體。
在Co-IP實驗中,已知抗原稱為誘餌蛋白,與之結(jié)合的蛋白則稱為靶蛋白。靶蛋白可能是一些復(fù)雜的伴侶蛋白、信號分子、結(jié)構(gòu)蛋白、輔助因子等,蛋白間相互作用強(qiáng)度范圍可能介于高度瞬時和十分穩(wěn)定之間。
基本的Co-IP實驗方案與IP相同,實際上任何IP系統(tǒng)均可用于Co-IP。但是,還有許多其他因素需要考慮,例如,結(jié)合和洗滌條件的優(yōu)化,優(yōu)化時,需要考慮到誘餌蛋白-靶蛋白的相互作用強(qiáng)度以及抗體-誘餌蛋白的親和力。
免疫沉淀技術(shù)的應(yīng)用。
Co-IP(Co-Immunoprecipitation,共免疫沉淀)的實驗方法通常包括以下步驟:
1. 細(xì)胞培養(yǎng)與裂解:細(xì)胞在適宜的培養(yǎng)條件下生長到適當(dāng)?shù)拿芏取?/span>
蛋白質(zhì)分離:裂解后的細(xì)胞混合物通過離心去除未破碎的細(xì)胞碎片和未裂解的細(xì)胞。收集上清液
2. 抗體的添加:將特異性抗體(針對目標(biāo)蛋白質(zhì)的抗體)加入到裂解物中。
3. 免疫復(fù)合物的形成:抗體與目標(biāo)蛋白結(jié)合后,形成免疫復(fù)合物。
4. 親和介質(zhì)的使用:向混合物中添加蛋白A或蛋白G結(jié)合的珠子(如瓊脂糖或磁性珠子)。
5. 免疫復(fù)合物的捕獲:將混合物與珠子孵育一段時間后,使用磁鐵或離心的方法將珠子收集起來,同時捕獲了與之結(jié)合的免疫復(fù)合物。
6. 洗滌:洗滌珠子以去除未特異性結(jié)合的蛋白質(zhì)和其他分子。
7. 洗脫:使用適當(dāng)?shù)木彌_液將免疫復(fù)合物從珠子上洗脫下來,常用的緩沖液包括SDS樣品緩沖液,用于后續(xù)的電泳分析。
8. 蛋白質(zhì)分析:洗脫的蛋白質(zhì)可以通過SDS-PAGE凝膠電泳、Western blot、質(zhì)譜分析等方法進(jìn)行進(jìn)一步分析。
9. 實驗對照:實驗中應(yīng)包括陽性對照和陰性對照,以確保實驗結(jié)果的可靠性。
10. 數(shù)據(jù)分析:對實驗結(jié)果進(jìn)行分析,確認(rèn)目標(biāo)蛋白是否成功沉淀,并鑒定任何可能的相互作用蛋白。
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“免疫沉淀”一般是指采用固定在固相支持物上的結(jié)合蛋白,進(jìn)行小規(guī)模的蛋白質(zhì)親和純化的實驗。更確切地說,IP是采用固定在微珠支持物(一般是瓊脂糖樹脂)上的特定抗體,從復(fù)雜的混合物中,純化單一抗原的實驗。固定化蛋白質(zhì)復(fù)合物的組裝既可以分步進(jìn)行,也可以一步完成。
常見的加樣順序:抗體和樣本(如細(xì)胞裂解物)一起孵育,然后加入親和微珠,用于捕獲抗體-抗原復(fù)合物。也可以將抗體和微珠(通過抗體結(jié)合蛋白,如蛋白A、G或A/G等,直接或間接結(jié)合抗體)先進(jìn)行孵育,然后再加入含有抗原的樣本。當(dāng)抗原、抗體和固相支持物產(chǎn)生結(jié)合以后,充分洗滌微珠,再采用適當(dāng)?shù)南疵摼彌_液從支持物上洗脫抗原。
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