《Protein Cell》解讀：CARM1與HIF1A互作結合至多個靶點啟動子，協調促進三陰性乳腺AI（TNBC）的進展

乳腺AI 就占女性AI癥的31%。女性乳腺AI 發(fā)病率一直在緩慢上升。三陰性乳腺AI （TNBC）惡性程度更高，且無有效治LIAO ，預后差。精氨酸甲基化是一種關鍵的翻譯后修飾（PTM），參與各種細胞過程。然而，關于CARM1在TNBC中的功能知之甚少。

2024年10月，中國醫(yī)學科學院和首都醫(yī)科大學基礎醫(yī)學院團隊聯合在Protein Cell（IF=13.6）上發(fā)表了題為“CARM1 drives triple-negative breast cancer progression by coordinating with HIF1A”的研究成果。揭示CARM1在TNBC中AI 變的分子基礎及其有效的天然抑制劑，可能為AI癥治LIAO 提供新的思路和藥物。

圖形摘要：

Highlights如下：

1）CARM1在乳腺AI 樣本中高表達，與組織學分級呈正相關；

2）CARM1促進TNBC進展；

3）CARM1與HIF1A協同促進TNBC的進展；

4）CARM1由HIF1A募集，占據CDK4、Cyclin D1、β-Catenin、HIF1A、MALAT1和SIX1的啟動子，這些基因在細胞周期、HIF-1信號通路、Wnt信號通路、VEGF信號通路中起關鍵作用，從而調節(jié)TNBC細胞的增殖和侵襲。

臨床相關性：

CARM1在乳腺AI 樣本中高表達。

功能研究：

過表達CARM1在體內、外促進TNBC細胞的增殖、侵襲、EMT和干細胞潛能，CARM1敲減則相反。

機制研究：

（1）鑒定CARM1的全基因組轉錄的轉錄靶標

通過anti-CARM1 ChIP-seq實驗，共鑒定出17,749個carm1特異性結合峰和4,866個獨特的啟動子基因（圖1a）。KEGG分析發(fā)現，這些基因參與HIF-1、Wnt、VEGF等信號通路（圖1b）。ChIP-qpcr檢測顯示，CARM1在CARM1、CDK4、Cyclin D1、β-Catenin、HIF1A、MALAT1, MAT2A、VEGFA和Vimentin等啟動子上強富集，驗證了ChIP-seq結果（圖1c）。對所選基因進行anti-H3R17me2a和anti-H3R26me2a ChIP-qpcr分析，顯示H3R17me2a和H3R26me2a占據了目標啟動子（圖1d）。進一步表明，這些啟動子被CARM1占據。敲減CARM1進行RNA-seq，KEGG分析顯示Wnt、HIF-1和VEGF信號通路富集（圖1e-f），這與ChIP-seq數據一致。此外，ChIP-seq中的啟動子基因（P < 0.001）與RNA-seq中下調的基因重疊（圖1g）。RT-qPCR和WB驗證了CARM1敲低引起的變化（圖1h-i）。

圖1 鑒定CARM1的全基因組轉錄的轉錄靶標（Ref. Fig 3）

（2）CARM1與HIF1A存在關聯并直接相互作用

第一步，篩選CARM1的互作蛋白

通過anti-Flag-CARM1 IP-MS鑒定與CARM1相互作用的蛋白，分析顯示CARM1與HIF1A存在關聯（圖2a）。

第二步，驗證CARM1與HIF1A相互作用

在常氧和缺氧條件下，進行Co-IP分析，CARM1和HIF1A相互作用（圖2b-e）。此外，GST pulldown實驗也證實CARM1與HIF1A互作（圖2f-g）。

第三步，確定CARM1與HIF1A互作具體的位置

構建截短載體GST-CARM1-EVH1結構域（1-140 aa）、GST-CARM1-cat（141-480 aa）和GST-CARM1-c（481-608 aa），進行GST pulldown實驗，表明CARM1的EVH1結構域負責與HIF1A相互作用（圖2h-j）。此外，構建突變體進行GST pulldown實驗，CARM1-?EVH1（141-608 aa）不能與HIF1A相互作用，甲基轉移酶失活的CARM1-R168A突變體不影響CARM1與HIF1A的相互作用（圖2k），即這種相互作用不是一種翻譯后修飾（PTM）的方式。同樣，構建GST-HIF1A bHLH結構域（1-80 aa）、GST-HIF1A-PAS （81-350 aa）、GST-HIF1A-ODD （351-600 aa）和GST-HIF1A-TAD（601-826 aa）進行GST pulldown實驗，顯示HIF1A的TAD結構域負責與CARM1相互作用（圖2l-m）。

第四步，CARM1與HIF1A互作結合CDK4、Cyclin D1、β-Catenin、HIF1A、MALAT1和SIX1的啟動子，調控其表達

接下來，用含缺氧反應元件（HREs）的pGL4.42載體轉染細胞，檢測常氧和缺氧條件下熒光素酶的活性（圖2n），發(fā)現CARM1直接調控缺氧信號通路。BIOBASE分析顯示CDK4、Cyclin D1、β-Catenin、HIF1A、MALAT1和SIX1的啟動子都具有潛在的HIF-1結合序列（圖2o）。表明，CARM1直接與HIF1A相互作用，并調節(jié)其表達。

圖2 CARM1與HIF1A存在物理關聯并直接相互作用（Ref. Fig 4/S4）

（2）HIF1A招募CARM1促進下游基因轉錄激HUO 

HIF1A是一種激HUO 基因轉錄的轉錄因子。前面的研究顯示CARM1與HIF1A互作，推測HIF1A/CARM1構成了一個激HUO 復合體，其功能是促進基因轉錄。

第一步，CARM1與HIF1A形成一個復合體，結合到下游靶標啟動子區(qū)

為了探究HIF1A與CARM1互作的功能意義，分別在常氧和缺氧條件下，進行anti-CARM1和anti-HIF1A ChIP-qpcr實驗，結果顯示CARM1和HIF1A共同占據了這些靶標（圖3a-b）。

第二步，CARM1與HIF1A形成一個復合體，結合到下游靶標啟動子區(qū)

為了驗證關于CARM1和HIF1A作為蛋白復合物占據目標啟動子的假設，在缺氧條件下進行ChIP-qpcr實驗。CARM1敲低明顯降低了HIF1A與CDK4、Cyclin D1、β-Catenin、HIF1A、MALAT1、SIX1和VEGFA啟動子的結合，反之亦然（圖3c-f）。同時，在敲低CARM1或HIF1A后，所有目標啟動子的H3R17me2a和RNA聚合酶II （RNA polymerase II, Pol II）水平均明顯降低（圖3c-f）。為了進一步驗證假設，對六個具有代表性的靶基因CDK4、Cyclin D1、β-Catenin、HIF1A、MALAT1和SIX1進行ChIP或ChIP-re-ChIP檢測?？扇苄匀旧|用anti-CARM1、HIF1A和H3R17me2a IP。以H3R17me2a為陽性對照。隨后使用抗體對免疫沉淀物進行再免疫沉淀。結果表明，在沉淀物中，被anti-CARM1免疫沉淀的CDK4、Cyclin D1、β-Catenin、HIF1A、MALAT1和SIX1啟動子可以被anti-HIF1A或H3R17me2a再次免疫沉淀（圖3g）。當使用anti-HIF1A或H3R17me2a進行初始ChIP檢測時，獲得類似的結果（圖3g）。

即HIF1A和CARM1作為一個蛋白質復合物占據CDK4、Cyclin D1、β-Catenin、HIF1A、MALAT1和SIX1的啟動子。

另外，在缺氧條件下敲減HIF1A或CARM1下調CDK4、Cyclin D1、β-Catenin、HIF1A、MALAT1和SIX1的mRNA和蛋白水平表達（圖3h）。綜上所述，HIF1A和CARM1作為一個整體與靶基因啟動子結合，并相互促進其募集和/或穩(wěn)定，共同發(fā)揮轉錄激HUO 的功能。

圖3 HIF1A招募CARM1促進下游基因轉錄激HUO （Ref. Fig 5）

結論：研究人員發(fā)現CARM1在乳腺AI 表達上調。功能上，CARM1上調與乳腺AI 進展相關，促進TNBC的增殖、侵襲、上皮間質轉化和細胞干性。CARM1的全基因組分析表明，CARM1占據CDK4、Cyclin D1、β-Catenin、HIF1A、MALAT1和SIX1的啟動子，這些基因在細胞周期、HIF-1、Wnt、VEGF信號通路中起關鍵作用。機制上，CARM1與HIF1A互作，并由HIF1A募集，占據CDK4、Cyclin D1、β-Catenin、HIF1A、MALAT1和SIX1的啟動子，從而調節(jié)TNBC細胞的增殖和侵襲。此外，CARM1的抑制劑鞣花酸可以通過直接抑制CDK4的表達來抑制TNBC的增殖和侵襲。該研究確定了CARM1AI 變的分子基礎及其有效的天然抑制劑，為AI癥治LIAO 提供新的思路和藥物。