O-糖基化修飾（O-GlcNAcylation）是近年來發(fā)現(xiàn)的一種發(fā)生在細胞內(nèi)蛋白絲氨酸或者蘇氨酸殘基上的單糖修飾，其失調(diào)與腫LIU等人類疾病的發(fā)生和發(fā)展密切相關。研究表明O-糖基化修飾在結(jié)直腸AI等多種腫LIU中明顯上調(diào)，然而其促進腫LIU發(fā)生和發(fā)展的機制有待進一步的研究。

2024年10月24日，浙江大學易文和朱強共同通訊在PNAS（IF=9.4）上發(fā)表了題為“O-GlcNAcylation of enolase 1 serves as a dual regulator of aerobic glycolysis and immune evasion in colorectal cancer”的研究成果。揭示O-糖基化通過調(diào)控烯醇化酶（enolase 1, E***）來影響結(jié)直腸AI糖代謝以及免疫逃逸的機制，強調(diào)干預E***糖基化可以作為結(jié)腸AI臨床治L的潛在策略。

圖形摘要：

Highlights如下：

1）E***在腫LIU組織中的表達明顯上調(diào)；

2）E***的酶活性是CRC細胞增殖和腫LIU生長所必需的；

3）E***在蘇氨酸19（T19）上的O-糖基化增強了其酶活性；

4）抑制E***兩個位點的糖基化能聯(lián)合PD-L1單抗協(xié)同抑制結(jié)直腸腫LIU生長；

5）E***中絲氨酸249（S249）上的糖基化則抑制其與PD-L1的相互作用，并阻斷泛素連接酶STUB1介導的PD-L1泛素化以及蛋白酶體降解，促進了 PD-L1蛋白表達，進而JI活 PD-1/ PD-L1 介導的腫LIU免疫逃逸。

臨床相關性：

E***在腫LIU組織中的表達水平明顯高于正常組織。

功能研究：

E***的T19 O-糖基化促進糖酵解和結(jié)直腸腫LIU生長；S249 O-糖基化抑制抗腫LIU活性并促進結(jié)直腸腫LIU生長。

機制研究：

（1）確定E***的O-糖基化修飾2個位點T19/S249，其中T19 O-糖基化影響其活性

第一步，E***存在O-糖基化修飾

越來越多的證據(jù)表明，O-糖基化會影響幾種關鍵代謝酶的活性，從而調(diào)節(jié)細胞代謝。為了確定E***是否被O-糖基化修飾，化學酶標記實驗發(fā)現(xiàn)OGA（O-連接的N-乙酰葡糖胺水解酶（O-GlcNAcase，OGA）是生物體內(nèi)唯YI水解蛋白質(zhì)O-糖基修飾的糖苷酶。）抑制劑TMG或?O-GlcNAc轉(zhuǎn)移酶（OGT）過表達的情況下，O-糖基化信號明顯升高（圖1a）。隨后用質(zhì)量標記方法分析E***的O-糖基化水平，5kDa的PEG分子與疊氮標記的糖蛋白結(jié)合，導致WB信號的分子移位。通過量化移位帶和未移位帶之間的強度之比，發(fā)現(xiàn)正常條件下，內(nèi)源性E***的修飾率約為27%（圖1b）。在不同濃度的葡萄糖、谷氨酰胺或血清時，E*** O-糖基化水平呈劑量依賴性增加（圖1c-e）。

第二步，鑒定E***上的O-糖基化位點

共表達HA-OGT和Flag-E***后，anti-Flag IP-MS質(zhì)譜分析發(fā)現(xiàn)E***上鑒定到4個O-糖基化位點（T19、T26、S27和S249）。分別構(gòu)建T19A、T26A、S27A和S249A突變體進行化學酶標記實驗，T19A和S249A突變體明顯降低了O-糖基化信號。雙位點突變（T19A/S249A）使糖基化信號減少了約80%，表明T19和S249是E***上主要的糖基化位點（圖1f-g）。此外，不同物種之間的序列比較表明，T19和S249都是進化保守的（圖1h）。

第三步，E*** T19上的O-糖基化影響其酶活

E***敲除后外源表達WT、T19A或S249A E***發(fā)現(xiàn)，T19A突變體，而不是S249A突變體，表現(xiàn)出明顯的活性降低（圖1i），使用TMG或過表達OGT處理同樣增加了WT和S249A E***的活性，但對T19A突變體沒有明顯影響（圖1i）。另外，在大腸桿菌中的共表達OGT和UDP-GlcNAc合成途徑中的關鍵酶，進一步驗證了該結(jié)果（圖1j）。表明E*** T19上的O-糖基化影響其酶活。

第四步，T19 O-糖基化促進形成E***二聚體增加E***活性

T19糖基化如何調(diào)控E***的活性？酶動力學研究發(fā)現(xiàn)，在OGT過表達的情況下，WT和S249A E***產(chǎn)生2-p-甘油的比較大速度（Vmax）都比T19A E***高得多（圖1k）。隨后研究T19糖基化是否會影響E***的低聚物化狀態(tài)。Co-IP實驗發(fā)現(xiàn)T19A E***破壞E***之間的結(jié)合；TMG處理則增強WT之間的互作，但沒有增強T19A E***之間的互作（圖1l）。另外，使用水溶性的交聯(lián)劑BS3（可與蛋白質(zhì)上的伯胺（-NH2）反應，以穩(wěn)定E***的寡聚化狀態(tài)）處理，發(fā)現(xiàn)O-糖基化增加了WT E***二聚體蛋白的數(shù)量，但對T19A突變體沒有明顯影響（圖1m）。表明T19 O-糖基化通過促進E***活性二聚體的形成來促進E***活性。

圖1 確定E***的O-糖基化修飾2個位點T19/S249，其中T19 O-糖基化影響其活性（Ref. Fig 2/S2）

（2）E***的S249 O-糖基化通過抑制STUB1和PD-L1的結(jié)合促進PD-L1的穩(wěn)定性

據(jù)報道，E***可以通過結(jié)合PD-L1增強PD-L1與E3連接酶STUB1的關聯(lián)，從而增加細胞中PD-L1的降解。

第一步，預測分析E***和PD-L1之間的互作

基于AlphaFold2預測分析發(fā)現(xiàn)位于與PD-L1相互作用界面的E***的四個關鍵殘基（N52、K54、K197和E250）（圖2a-b）。

第二步，E***的E250介導與PD-L1相互作用

對每個殘基構(gòu)建N52A、K54A、K197A和E250A突變體，Co-IP分析發(fā)現(xiàn)E250突變?yōu)楸彼幔‥250A）明顯降低了E***與PD-L1之間的相互作用（圖2c）。另外，分析還發(fā)現(xiàn)E***的E250能夠與PD-L1上的R125形成臨界鹽橋，從而增強相互作用的穩(wěn)定性（圖2a）。表明E***的E250在介導PD-L1相互作用中的重要作用。

第三步，E***上E250附近S249糖基化影響其與PD-L1相互作用

構(gòu)建全長E***及其各種截斷突變體（N端區(qū)域、DNA結(jié)合域和C端區(qū)域），GST pulldown實驗顯示只有全長的E***和E***的C端區(qū)域（包含S249糖基化位點）顯示出與PD-L1的結(jié)合信號（圖2d）。提示靠近關鍵E250殘基的S249上的大量糖基化修飾可能會破壞與PD-L1的相互作用。Co-IP分析發(fā)現(xiàn)，過表達WT E***明顯減少PD-L1水平；而過表達S249A E***，且無論是否存在OGT過表達，PD-L1均無明顯變化（圖2e-f）。進一步探討E*** O-糖基化對WT、T19A或S249A E***與內(nèi)源性PD-L1相互作用的影響。Co-IP分析顯示，過表達WT或T19A E***后，OGT過表達增加O-糖基化水平，但降低了E***與PD-L1互作，并伴有PD-L1蛋白水平的升高，而在過表達S249A E***的細胞中沒有觀察到這種作用（圖2g-h）。類似的，TMG處理也增加了WT E***重組細胞中的PD-L1蛋白水平，但在S249A重組細胞中沒有（圖2i-j）。表明E***上E250附近S249糖基化抑制其與PD-L1互作，降低PD-L1的蛋白水平。

第四步，E*** S249 O-糖基化通過蛋白酶體降解途徑抑制PD-L1的表達

Qpcr檢測發(fā)現(xiàn)OGT的過表達并未改變PD-L1 mRNA水平，表明PD-L1的調(diào)控機制與轉(zhuǎn)錄無關（圖2k）。分析PD-L1的半衰期，發(fā)現(xiàn)TMG可促進WT E***過表達細胞中PD-L1的穩(wěn)定性，但對S249A E***過表達細胞無促進作用。此外，蛋白酶體抑制劑MG132，而不是溶酶體抑制劑氯喹（CQ）或自噬抑制劑3-甲基腺嘌呤（3-MA），挽救了S249A E***過表達細胞中PD-L1的降解（圖2l），表明E*** S249 O-糖基化通過蛋白酶體降解途徑抑制PD-L1的表達。

圖2 E***上E250附近S249糖基化影響其與PD-L1相互作用（Ref. Fig 4/S4/S5）

第五步，E***促進PD-L1與STUB1的結(jié)合

據(jù)報道，E***通過募集E3連接酶STUB1調(diào)節(jié)PD-L1的蛋白酶體降解。敲減STUB1，PD-L1表達增加（圖3a）。IP-WB實驗發(fā)現(xiàn)PD-L1泛素化降低，證實STUB1是CRC細胞中PD-L1的E3連接酶（圖3a）。此外，E***的缺失增加了PD-L1水平，IP-WB顯示PD-L1泛素化降低，重新表達WT E***逆轉(zhuǎn)了這種效應（圖3b-c）。相反，過表達E***可抑制PD-L1的表達，敲減STUB1，則抑制作用被消除（圖3d）。另外，內(nèi)源性Co-IP實驗發(fā)現(xiàn)E***的缺失抑制PD-L1與STUB1互作（圖3e），而E***過表達則以劑量依賴性的方式增強PD-L1與STUB1互作（圖3f）。GST pulldown實驗也證實該結(jié)果（圖3g）。表明E***促進了PD-L1與STUB1的結(jié)合。

第六步，E***糖基化通過減少PD-L1與STUB1的結(jié)合來抑制PD-L1的蛋白酶體降解

推測E***糖基化通過減少PD-L1與STUB1的結(jié)合來抑制PD-L1的蛋白酶體降解（圖3h）。為了驗證這一點，Co-IP分析發(fā)現(xiàn)，在WT E***過表達細胞中，TMG處理后，降低PD-L1泛素化及其與STUB1的互作，但在S249A E***過表達細胞中沒有降低（圖3i）。此外，WB檢測顯示，過表達OGT可增強WT E***過表達細胞中PD-L1的表達，而在S249A E***過表達細胞中則無此作用。而敲減STUB1抵消這種增加（圖3j）。

表明E***糖基化阻斷了其與PD-L1的相互作用，減少了STUB1與PD-L1的相互作用，從而抑制了STUB1介導的泛素化和PD-L1的蛋白酶體降解。

圖3 E***糖基化通過減少PD-L1與STUB1的結(jié)合來抑制PD-L1的蛋白酶體降解（Ref. Fig 4/S6/S7）

結(jié)論：研究人員發(fā)現(xiàn)E***的表達水平在結(jié)腸AI組織中明顯上調(diào)。功能上，E***促進腫LIU生長。機制上，質(zhì)譜分析和實驗驗證提示蘇氨酸19位（T19）以及絲氨酸249位(S249)是E***上主要的糖基化修飾位點。一方面，T19的糖基化通過促進活性二聚體的形成提高了其酶活性，促進腫LIU生長；另一方面，研究團隊發(fā)現(xiàn)S249的糖基化抑制了E***與PD-L1的互作，并阻斷了STUB1介導的PD-L1泛素化以及蛋白酶體降解，促進了 PD-L1蛋白表達，進而JI活 PD-1/ PD-L1 介導的腫LIU免疫逃逸。此外，抑制E***兩個位點的糖基化能聯(lián)合PD-L1單抗協(xié)同抑制結(jié)直腸腫LIU生長。提示E***的糖基化在結(jié)直腸AI臨床免疫治L和檢測中具有重要的意義。