利用IP/RIP技術(shù)揭示乳腺BING circRNA編碼肽的

來源：發(fā)布時間：2024-09-02

乳腺AI已成為"全球比較大的AI"，近年來其發(fā)BING率呈迅速增長趨勢。值得注意的是，三陰性乳腺AI(TNBC)占所有乳腺AI亞型的15-20%，是惡性的亞型，具有嚴(yán)重的增殖和侵襲性表型。努力篩選出可靠的YAO物靶點，改善TNBC患者的預(yù)后是當(dāng)務(wù)之急。

2023年7月，中GUO農(nóng)業(yè)大學(xué)李向東課題組聯(lián)合解放Jun總YI院、芬蘭Turku大學(xué)醫(yī)學(xué)院、波蘭Bialystok醫(yī)科大學(xué)等單位在Molecular Cancer發(fā)表“A novel polypeptide CAPG-171aa encoded by circCAPG plays a critical role in triple-negative breast cancer”的論WEN，該研究對環(huán)狀RNA-circCAPG編碼肽促進TNBC發(fā)展的分子機制進行了深入的解析，揭示了環(huán)狀RNA-circCAPG編碼一個未知多肽促進TNBC發(fā)展的分子機制。

圖形摘要如下：

Highlights如下：

1) circCAPG在TNBC中高表達。circCAPG的敲低抑ZHI TNBC患者來源的類器Guan的生長。

2) circCAPG可以翻譯成一個名為CAPG-171aa的多肽。通過IP實驗找到 CAPG-171aa的互作蛋白STK38，進一步IP分析發(fā)現(xiàn)CAPG-171aa通過破壞STK38與SMURF1的結(jié)合，阻止MEKK2泛素化和蛋白酶體降解，從而促進腫LIU生長。

3）circRNA機制研究常常作為RNA形態(tài)與miRNA、蛋白質(zhì)互作，而具有編碼潛能的circRNA研究報道較少，circRNA編碼肽的功能研究更具創(chuàng)新性，改變了對非編碼RNA的傳統(tǒng)認(rèn)知。

臨床相關(guān)性：

分析GEO數(shù)據(jù)庫數(shù)據(jù)集。在TNBC中，circCAPG的表達水平上調(diào)。circCAPG在TNBC細胞系中高表達。circCAPG在惡性程度較高的TNBC組ZHI中的表達高于晚期，circCAPG表達水平越高，TNBC患者的預(yù)后越差。

功能研究：

在TNBC細胞株中，敲減circCAPG，抑ZHI TNBC細胞增殖、遷移和侵襲；circCAPG敲減組的腫LIU體積和重量均降低，TNBC類器Guan模型顯示，circCAPG敲減抑ZHI TNBC類器Guan的生長，而過表達circCAPG則相反。

機制研究：

circCAPG通常與miRNA、蛋白質(zhì)相互作用。為了探索circCAPG是否通過與miRNA相互作用來抑ZHI TNBC的進展，進行anti-AGO2（RIP）實驗，結(jié)果顯示下拉物中沒有circCAPG富集（圖1）。

circRNADb數(shù)據(jù)庫預(yù)測和雙熒光素酶基因報告實驗顯示circCAPG可能編碼一個171個氨基酸的蛋白質(zhì)。分別對突變體circCAPG-FLAG/-FLAG-IRES-mut/-FLAG-ATG-mut進行IP實驗，下拉物Western blot顯示，只有circCAPG-FLAG可以翻譯成一個名為CAPG-171aa的多肽(圖1D和E)。

圖1 CircCAPG編碼一種名為CAPG-171aa的新蛋白（Ref. Fig3/FigS3）

為了解CAPG-171aa調(diào)控TNBC進展的潛在分子機制，對CAPG-171aa進行IP實驗，質(zhì)譜檢測其潛在的互作蛋白分子（圖2A）。在大量的互作蛋白中，終挑選9個蛋白進行IP-WB驗證，且只有STK38能與TNBC細胞中的CAPG-171aa結(jié)合(圖2B)。此外，STK38與母體CAPG無相互作用(圖2C)。

圖2 STK38是CAPG-171aa的相互作用蛋白（Ref. Fig5/ FigS5）

既往研究表明，STK38可以調(diào)節(jié)MYC蛋白的穩(wěn)定性，并通過與SMURF1結(jié)合，促進MEKK2的泛素化和降解。

通過使用anti-MEKK2進行IP分析，發(fā)現(xiàn)MEKK2可與STK38和SMURF1相互作用(圖3A)。進一步anti-SMURF1 IP分析研究證明，OE-CAPG-171aa能降低STK38和SMURF1之間的相互作用(圖3B)。此外，anti-MEKK2 IP分析還發(fā)現(xiàn)OE-CAPG-171aa降低MEKK2的泛素化，增加MEKK2蛋白水平(圖3C)。相應(yīng)的，MEKK2的泛素信號在circCAPG敲減的TNBC細胞株中增加(圖3D)。后續(xù)功能回復(fù)實驗，MEKK2 KD可以降低CAPG-171aa-OE TNBC細胞系的細胞增殖、遷移和侵襲能力，表明MEKK2是CAPG-171aa的下游伴侶。

圖3 CAPG-171aa與STK38互作，通過MEKK2激Huo下游MEK1/2-ERK1/2通路（Ref. Fig6）

結(jié)論：

circCAPG通過編碼新的多肽CAPG-171aa，進而激HuoMEKK2-MEK1/2-ERK1/2通路，增強TNBC細胞的增殖和轉(zhuǎn)移。本研究通過IP-MS尋找CAPG-171aa的潛在互作蛋白，對其中的9個蛋白質(zhì)進行驗證，找到一個陽性互作蛋白STK38。然后通過多次IP實驗發(fā)現(xiàn)CAPG-171aa通過破壞STK38與SMURF1的結(jié)合，阻止MEKK2泛素化和蛋白酶體降解機制。該研究為蛋白質(zhì)編碼circRNAs CAPG-171aa在TNBC中的作用提供了創(chuàng)新性見解，并有望作為TNBC的預(yù)后生WU標(biāo)志物和潛在診LIAO靶點。