因斯蔻浦(上海)生物科技有限公司 雙光子顯微鏡的基本原理是：在高光子密度的情況下，熒光分子可以同時吸收 2 個長波長的光子，在經(jīng)過一個很短的所謂激發(fā)態(tài)壽命的時間后，發(fā)射出一個波長較短的光子；其效果和使用一個波長為長波長一半的光子去激發(fā)熒光分子是相同的。雙光子激發(fā)需要很高的光子密度，為了不損傷細(xì)胞，雙光子顯微鏡使用高能量鎖模脈沖激光器。這種激光器發(fā)出的激光具有很高的峰值能量和很低的平均能量，其脈沖寬度只有 100 飛秒，而其周期可以達(dá)到 80至100兆赫茲。在使用高數(shù)值孔徑的物鏡將脈沖激光的光子聚焦時，物鏡的焦點(diǎn)處的光子密度是比較高的，雙光子激發(fā)只發(fā)生在物鏡的焦點(diǎn)上，所以雙光子顯微鏡不需要共聚焦***，提高了熒光檢測效率。中國市場多光子顯微鏡產(chǎn)量、消費(fèi)量、進(jìn)出口分析及未來趨勢。美國多光子顯微鏡設(shè)備

2020年，JianglaiWu等人提出提高2PM橫向掃描速率的裝置，稱為FACED（free-spaceangular-chirp-enhanceddelay）。圓柱透鏡將激光束一維聚焦，會聚角為Δθ。光束進(jìn)入到一對幾乎平行的高反射鏡中，其間距為S，偏角為α。經(jīng)過反射鏡多次反射后，激光脈沖被分成多個傳播方向不同的子脈沖（N=Δθ/α），脈沖間以2S/c的時間延遲（c，光速）回射。FACED模塊輸出處的子脈沖序列可以看作從虛擬光源陣列發(fā)出的光，這些子脈沖在中繼到顯微鏡物鏡后形成了一個空間上分離且時間延遲的焦點(diǎn)陣列。然后將該模塊并入具有高速數(shù)據(jù)采集系統(tǒng)的標(biāo)準(zhǔn)雙光子熒光顯微鏡中。光源是具有1MHz重復(fù)頻率的920nm的激光器，通過FACED模塊可產(chǎn)生80個脈沖焦點(diǎn)，其脈沖時間間隔為2ns。這些焦點(diǎn)是虛擬源的圖像，虛擬源越遠(yuǎn)，物鏡處的光束尺寸越大，焦點(diǎn)越小。光束沿y軸比x軸能更好地充滿物鏡，從而導(dǎo)致x軸的橫向分辨率為0.82μm，y軸的橫向分辨率為0.35μm。美國清醒動物多光子顯微鏡實(shí)驗(yàn)操作多光子顯微鏡的成熟的深部組織成像技術(shù)中。還有其他類型的圖像對比提供有關(guān)樣本的有價值信息。

    繼首代小型化雙光子顯微鏡在國際上獲得小鼠自由行為過程中大腦神經(jīng)元和突觸的動態(tài)圖像后，我們成功研制了第二代小型化雙光子顯微鏡。它具有更大的成像視野和三維成像能力，可以清晰穩(wěn)定地對自由活動小鼠三維腦區(qū)的數(shù)千個神經(jīng)元進(jìn)行成像，實(shí)現(xiàn)對同一批神經(jīng)元的一個月追蹤記錄。通過對微光學(xué)系統(tǒng)的重新設(shè)計系統(tǒng)的。微物鏡工作距離延長至1mm，實(shí)現(xiàn)無創(chuàng)成像。內(nèi)嵌可拆卸的快速軸向掃描模塊，可采集深度180微米的3D體成像和多平面快速切換的實(shí)時成像。該掃描模塊由一個快速的電動變焦透鏡和一對中繼透鏡組成，在不同深度成像時可保持放大倍率恒定。其變焦模塊重量，研究人員可根據(jù)實(shí)驗(yàn)需求自由拆卸。此外，新版微型化成像探頭可整體即時拔插，極大地簡化了實(shí)驗(yàn)操作，避免了長周期實(shí)驗(yàn)時對動物的干擾。在重復(fù)裝卸探頭同一批神經(jīng)元時，視場旋轉(zhuǎn)角小于，邊界偏差小于35微米。

與傳統(tǒng)的單光子寬視野熒光顯微鏡相比，多光子顯微鏡（MPM）具有光學(xué)切片和深層成像等功能，這兩個優(yōu)勢極大地促進(jìn)了研究者們對于完整大腦深處神經(jīng)的了解與認(rèn)識。2019年，JeromeLecoq等人從大腦深處的神經(jīng)元成像、大量神經(jīng)元成像、高速神經(jīng)元成像這三個方面論述了相關(guān)的MPM技術(shù)。想要將神經(jīng)元活動與復(fù)雜行為聯(lián)系起來，通常需要對大腦皮質(zhì)深層的神經(jīng)元進(jìn)行成像，這就要求MPM具有深層成像的能力。激發(fā)和發(fā)射光會被生物組織高度散射和吸收是限制MPM成像深度的主要因素，雖然可以通過增加激光強(qiáng)度來解決散射問題，但這會帶來其他問題，例如燒壞樣品、離焦和近表面熒光激發(fā)。增加MPM成像深度比較好的方法是用更長的波長作為激發(fā)光。雙光子熒光顯微鏡是結(jié)合了激光掃描共聚焦顯微鏡和雙光子激發(fā)技術(shù)的一種新技術(shù)。

使用MPM對神經(jīng)元進(jìn)行成像時，通過隨機(jī)訪問掃描—即激光束在整個視場上的任意選定點(diǎn)上進(jìn)行快速掃描—可以只掃描感興趣的神經(jīng)元，這樣不僅避免掃描到任何未標(biāo)記的神經(jīng)纖維，還可以優(yōu)化激光束的掃描時間。隨機(jī)訪問掃描可以通過聲光偏轉(zhuǎn)器（AOD）來實(shí)現(xiàn)，其原理是將具有一個射頻信號的壓電傳感器粘在合適的晶體上，所產(chǎn)生的聲波引起周期性的折射率光柵，激光束通過光柵時發(fā)生衍射。通過射頻電信號調(diào)控聲波的強(qiáng)度和頻率從而可以改變衍射光的強(qiáng)度和方向，這樣使用1個AOD就可以實(shí)現(xiàn)一維橫向的任意點(diǎn)掃描，利用1對AOD，結(jié)合其他軸向掃描技術(shù)可實(shí)現(xiàn)3D的隨機(jī)訪問掃描。但是該技術(shù)對樣本的運(yùn)動很敏感，易出現(xiàn)運(yùn)動偽影。目前，快速光柵掃描即在FOV中進(jìn)行逐行掃描，由于利用算法可以輕松解決運(yùn)動偽影而被普遍的使用。多光子顯微鏡的發(fā)展歷史充滿了貢獻(xiàn)、開發(fā)、進(jìn)步和數(shù)個世紀(jì)以來多個來源和地點(diǎn)的改進(jìn)。Ultima Investigator多光子顯微鏡成像區(qū)域

使用雙光子顯微鏡觀察標(biāo)本的時候，只有在焦平面上才有光漂白和光毒性。美國多光子顯微鏡設(shè)備

從產(chǎn)品類型及技術(shù)方面來看，正置顯微鏡占據(jù)絕大多數(shù)市場。2020年，全球多光子激光掃描正置顯微鏡市場達(dá)到87.30百萬美元，預(yù)計到2027年該部分市場將達(dá)到154.02百萬美元，年復(fù)合增長率（2021-2027）為8.48%。中國多光子激光掃描正置顯微鏡市場達(dá)到13.32百萬美元，預(yù)計到2027年該部分市場將達(dá)到25.21百萬美元，年復(fù)合增長率（2021-2027）為9.58%。從產(chǎn)品市場應(yīng)用情況來看，研究機(jī)構(gòu)為主要應(yīng)用領(lǐng)域，2020年約占全球市場46.28%。2020年，全球多光子激光掃描顯微鏡研究機(jī)構(gòu)應(yīng)用消費(fèi)量為174臺，預(yù)計2027年達(dá)到349臺，2021-2027年復(fù)合增長率（CAGR）為9.72%。美國多光子顯微鏡設(shè)備