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來源: 發(fā)布時間:2024-07-05

單光子顯微技術(shù)是成熟的熒光顯微技術(shù),但由于其使用的激發(fā)光波長較短,成像深度有限;能量較大,會造成對熒光物質(zhì)的漂白,光毒性嚴(yán)重。激光共焦掃描顯微鏡由于共焦顯微鏡的孔徑很小,實現(xiàn)樣本三維成像要逐點掃描,成像速度慢,對樣本損害大,很難用于長時間活細(xì)胞成像。而寬場顯微鏡能夠很好地實現(xiàn)實時動態(tài)成像,光漂白小,因而較早應(yīng)用于活細(xì)胞內(nèi)的實時檢測,但寬場顯微鏡由于離焦信號的干擾,難以實現(xiàn)多維成像。雙光子熒光顯微鏡(Two-PhotonLaser-ScanningMicroscopy)。雙光子顯微成像技術(shù)是近些年發(fā)展起來的結(jié)合了共聚焦激光掃描顯微鏡和雙光子激發(fā)技術(shù)的一種新型非線性光學(xué)成像方法,采用長波激發(fā),能對組織進行深層次成像。常用的比較好激發(fā)波長大多位于800-900nm,而水、血液和固有組織發(fā)色團對這個波段的光吸收率低,此外散射的激發(fā)光子不能激發(fā)樣品,因此背景第,光損傷小,適用于在體檢測。雙光子熒光成像技術(shù)能準(zhǔn)確定位細(xì)胞內(nèi)置入的微電極位置,從而觀察胞體、樹突甚至單個樹突棘的活性。研究者可完整的觀察神經(jīng)組織的分辨熒光圖像,甚至可以分辨神經(jīng)細(xì)胞單個樹突棘中的鈣分布。雙光子顯微鏡只有焦平面處才能形成雙光子吸收,而焦平面之外由于光強低無法被發(fā)動,所以雙光子成像更清晰。進口熒光雙光子顯微鏡廠家電話

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在2020年12月22日,臨研所、病理科和科研處邀請北京大學(xué)王愛民副教授做了題目為“新一代微型雙光子顯微成像系統(tǒng)介紹及其在臨床醫(yī)療診斷”的學(xué)術(shù)報告。學(xué)術(shù)報告由臨研所醫(yī)學(xué)實驗研究平臺潘琳老師主持。王愛民,北京大學(xué)信息科學(xué)技術(shù)學(xué)院副教授,畢業(yè)于北京大學(xué)物理系,獲學(xué)士、碩士學(xué)位,后于英國巴斯大學(xué)物理系獲博士學(xué)位。該研究組研發(fā)的微型雙光子顯微鏡,第1次在國際上獲得了小鼠大腦神經(jīng)元和神經(jīng)突觸清晰穩(wěn)定的動態(tài)信號,該成果獲得了2017年度“中國光學(xué)進展”和“中國科學(xué)進展”,并被NatureMethods評為2018年度“年度方法--無限制行為動物成像”。目前,該研究組正在研究新一代雙光子顯微成像技術(shù)在臨床診斷中的應(yīng)用,為未來即時病理、離體組織檢測、術(shù)中診斷等提供新的影像手段和分析方法。國外雙光子顯微鏡用途雙光子顯微鏡可以進行厚的組織樣品拍攝。

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雙光子之源:飛秒激光:雙光子吸收理論早在1931年就由諾獎得主MariaGoeppertMayer提出,30年后因為有了激光才得到實驗驗證,但是到WinfriedDenk發(fā)明雙光子顯微鏡又用了將近30年。要理解雙光子的技術(shù)挑戰(zhàn)和飛秒激光發(fā)揮的重要作用,首先要了解其中的非線性過程。雙光子吸收相當(dāng)于和頻產(chǎn)生非線性過程,這要求極高的電場強度,而電場取決于聚焦光斑大小和激光脈寬。聚焦光斑越小,脈寬越窄,雙光子吸收效率越高。對于衍射極限顯微鏡,聚焦在樣品上的光斑大小只和物鏡NA和激光波長有關(guān),所以關(guān)鍵變量只剩下激光脈寬?;谝陨戏治?,能夠以高重頻(100MHz)輸出超短脈沖(100fs量級)的飛秒激光器成了雙光子顯微鏡的標(biāo)準(zhǔn)激發(fā)光源。這也再次說明雙光子顯微鏡的優(yōu)勢:只有焦平面處才能形成雙光子吸收,而焦平面之外由于光強低無法被激發(fā),所以雙光子成像更清晰。WinfriedDenk初使用的光源是染料飛秒激光器(100fs脈寬、630nm可見光波長)。雖然染料激光器對于實驗室演示尚可,但是使用很不方便所以遠(yuǎn)未實現(xiàn)商用。很快雙光子顯微鏡的標(biāo)配光源就變成了飛秒鈦寶石激光器。除了固態(tài)光源優(yōu)勢,鈦寶石激光器還具有較寬的近紅外波長調(diào)諧范圍,而近紅外相比可見光穿透更深,對生物樣品損傷更小。

共聚焦顯微可以呈現(xiàn)這么漂亮的圖像,是不是什么樣品都可以用共聚焦顯微鏡拍拍拍.....得到各種各樣清晰漂亮的圖像呢?答案是否定的,任何事物都有優(yōu)缺點,何況一臺儀器呢,共聚焦顯微鏡也是有自己的局限,共聚焦有哪些局限呢:1.共聚焦顯微鏡只能拍攝約200um以內(nèi)的的樣品,對于厚的或者樣品不能進拍攝;2.共聚焦顯微鏡由于是逐點進行掃描,對樣品的光毒性還是比較大的,特別是拍攝活細(xì)胞樣品時就更容易對樣品進行淬滅;3.由于光照射的區(qū)域幾乎能通過這個Z軸的層面,所以對于空間定點光刺激的實驗定點位置就不是特別精確;并且激光共聚焦顯微鏡沒有純紫外進行激發(fā),對于一些特殊激發(fā)波長的實驗,效率非常低。微型雙光子顯微鏡的優(yōu)勢是。

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雙光子熒光顯微鏡是結(jié)合了激光掃描共聚焦顯微鏡和雙光子激發(fā)技術(shù)的一種新技術(shù)。雙光子激發(fā)的基本原理是:在高光子密度的情況下,熒光分子可以同時吸收2個長波長的光子,在經(jīng)過一個很短的所謂激發(fā)態(tài)壽命的時間后,發(fā)射出一個波長較短的光子;其效果和使用一個波長為長波長一半的光子去激發(fā)熒光分子是相同的。雙(多)光子成像優(yōu)勢在于,具有更深的組織穿透深度,利用紅外光,能夠在層面檢測極限達(dá)1mm的組織區(qū)域;因信號背景比高,而具有更高的對比度;因激發(fā)體積小,具有定點激發(fā)的特性,具有更少的光毒性;激發(fā)波長由紫外、可見光調(diào)整為紅外激發(fā),能夠更加地安全。雙光子顯微鏡還可以對一些具有雙光子特性的染料細(xì)胞進行特定實驗;國外雙光子顯微鏡用途

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在傳統(tǒng)寬場顯微鏡中,來自標(biāo)本不同縱深的光線都可投射到同一焦平面(感光元件)上,所以其成像是整個樣品的重疊像,沒有縱向分辨能力。單光子激光共聚焦顯微鏡用***有效濾除了雜散光,分辨率有了本質(zhì)上的提高,擁有了對樣品的特定焦平面精細(xì)成像的能力,可以進行三維成像、動態(tài)成像等。然而,***在濾除雜散光的同時也將大部分來自焦平面的熒光濾除了,只有很弱的熒光到達(dá)檢測器。若要提高信號強度,需要加大激發(fā)光功率,這又會導(dǎo)致對活細(xì)胞的光毒性和熒光分子的光漂白增加。雙光子顯微鏡比較大的優(yōu)勢來源于其雙光子光源的非線性光學(xué)效應(yīng),與單光子共聚焦顯微鏡比較大的不同在于無須使用***限制光學(xué)散射,其具體優(yōu)勢如下。進口熒光雙光子顯微鏡廠家電話

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