通過對微型光學(xué)系統(tǒng)的重新設(shè)計，F(xiàn)HIRM-TPM2.0成像視野擴大至420×420平方微米，微型物鏡的工作距離擴展至1毫米，以實現(xiàn)非侵入式成像；嵌入了可拆卸的快速軸向掃描模塊，實現(xiàn)了180微米深度的三維體成像和多平面快速切換的實時成像。該模塊由一個快速的電動變焦透鏡和一對中繼透鏡組成，在不同深度成像時保持放大倍率恒定。其中，變焦模塊重量1.8克，研究人員可根據(jù)實驗需求自由拆卸。此外，新版微型化成像探頭還可整體即時拔插，極大地簡化了實驗操作，避免了長周期實驗時對動物的干擾。在重復(fù)裝卸探頭追蹤同一批神經(jīng)元時，視場旋轉(zhuǎn)角小于0.07弧度，邊界偏差小于35微米。雙光子顯微鏡已成為較厚有生命體生物組織三維成像中不可或缺的工具。熒光雙光子顯微鏡光毒性

在該自適應(yīng)光學(xué)雙光子熒光顯微鏡中，她們將空間光位相調(diào)制器光學(xué)共軛到顯微物鏡的后焦平面，通過位相調(diào)制器將入射光分成若干子區(qū)域，每一塊子區(qū)域的波前都可以被控制。同時，她們用數(shù)字微陣列光處理器，以不同的頻率同時調(diào)制其中一半子區(qū)域的入射光強度，以另一半子區(qū)域作為“參考波前”。來自所有子區(qū)域光束會在焦點處會聚干涉，通過監(jiān)測焦點激發(fā)的雙光子信號隨時間的變化情況，并進行傅里葉變換分析，可以“分解”得到被調(diào)制的每一塊子區(qū)域的“光線”的貢獻信息，從而可以實現(xiàn)對一半子區(qū)域波前的并行測量。對另一半子區(qū)域重復(fù)這一測量過程，從而獲得整個入射波前的信息并進行校正。該方法耗時很短，通常約1~3分鐘左右即可完成像差的測量和校正，無需復(fù)雜的計算，適用于任何標(biāo)記密度和標(biāo)記類型的樣品。更重要的是，得到的像差校正圖案可以用于提高較大視場范圍內(nèi)的成像質(zhì)量。該方法無疑為在體研究小鼠大腦皮層深層區(qū)域的生物、醫(yī)學(xué)問題提供了可行性方案。進口investigator雙光子顯微鏡光損傷雙光子顯微鏡使用長波長脈沖光，是通過物鏡匯聚的。

雙光子熒光顯微鏡是結(jié)合了激光掃描共聚焦顯微鏡和雙光子激發(fā)技術(shù)的一種新技術(shù)。雙光子激發(fā)的基本原理是：在高光子密度的情況下，熒光分子可以同時吸收2個長波長的光子，在經(jīng)過一個很短的所謂激發(fā)態(tài)壽命的時間后，發(fā)射出一個波長較短的光子；其效果和使用一個波長為長波長一半的光子去激發(fā)熒光分子是相同的。雙（多）光子成像優(yōu)勢在于，具有更深的組織穿透深度，利用紅外光，能夠在層面檢測極限達1mm的組織區(qū)域；因信號背景比高，而具有更高的對比度；因激發(fā)體積小，具有定點激發(fā)的特性，具有更少的光毒性；激發(fā)波長由紫外、可見光調(diào)整為紅外激發(fā)，能夠更加地安全。

與普通顯微鏡相比，電子顯微鏡可以在更小的尺度上觀察事物，冷凍電子顯微鏡可以觀察活性生物大分子。雙光子顯微鏡有什么優(yōu)勢？它能做普通光學(xué)顯微鏡做不到的事情嗎？原來雙光子顯微鏡可以準(zhǔn)確穿透厚標(biāo)本進行定點和***觀察！因為電磁波的波長越短，粒子越強，散射的影響越大。雙光子顯微鏡將激發(fā)光源改為長波長激光，增加了激光的穿透力，同時降低了對細胞的毒性。此外，由于雙光子激發(fā)效應(yīng)只能發(fā)生在物鏡的焦點處，因此掃描精度極高，還可以提高激發(fā)光效率，減少掃描點以外的熒光物質(zhì)的消耗。如果已經(jīng)有了飛秒光，就可以幾套雙光子顯微鏡共享一臺，只需分光即可。

利用鈣成像技術(shù)記錄大腦活動，隨著功能光學(xué)成像技術(shù)的發(fā)展，神經(jīng)學(xué)家們已經(jīng)可以研究腦區(qū)和神經(jīng)元內(nèi)部的工作情況。功能鈣成像技術(shù)就是其中之一，其主要原理是將外源性熒光信號和生理現(xiàn)象耦合起來——通過熒光染料信號的改變反映細胞內(nèi)游離鈣離子濃度，以此細胞的功能狀態(tài)。目前它被廣泛應(yīng)用于實時監(jiān)測一群相關(guān)神經(jīng)元內(nèi)鈣離子的變化，從而判斷其功能活動。該技術(shù)的出現(xiàn)使得科學(xué)家可以親眼目睹神經(jīng)信號在神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)之中時間和空間上的傳遞穿梭。在深度組織中以較長時間對細胞成像，雙光子顯微鏡是當(dāng)前之選。國外雙光子顯微鏡授權(quán)公司

雙光子顯微鏡在多個領(lǐng)域研究中已有許多成功實例。熒光雙光子顯微鏡光毒性

和很多偉大的科學(xué)發(fā)明一樣，雙光子顯微鏡的出現(xiàn)也有一點偶然，但正是那瞬間的靈感為生物科學(xué)尤其是神經(jīng)科學(xué)帶來了一種**性的成像技術(shù)：雙光子激發(fā)熒光顯微鏡。1990年初，當(dāng)WinfriedDenk剛從康奈爾大學(xué)博士畢業(yè)準(zhǔn)備前往瑞士讀博后時，他看了一本關(guān)于激光掃描顯微鏡的書，從中了解到非線性光學(xué)效應(yīng)——強光和物質(zhì)的相互作用。當(dāng)時，Denk有同事研究生物樣品中的鈣離子但苦于沒有強大的紫外激光器和光學(xué)元件，于是他就想到如果使用雙光子吸收就能夠繞開紫外，換言之，與其通過一個紫外光子激發(fā)標(biāo)記的鈣離子，通過兩個雙倍波長的可見光光子也能激發(fā)相同的熒光。有了想法后馬上實驗。借了一套染料飛秒激光器，Denk聯(lián)合他的導(dǎo)師WattWebb及其博士生JamesStrickler只用六個小時就完成了實驗搭建，采集數(shù)據(jù)則用了兩到三天，于是一篇里程碑式的文章就此誕生了。熒光雙光子顯微鏡光毒性