膜片鉗技術(shù)的發(fā)展∶全自動膜片鉗技術(shù)(Automated patch clamp technique)的出現(xiàn)標(biāo)志著膜片鉗技術(shù)已經(jīng)發(fā)展到了一個嶄新階段,從這個意義上說,前面所講的膜片鉗技術(shù)我們稱之為傳統(tǒng)膜片鉗技術(shù)( Traditional patch clamp technique),傳統(tǒng)膜片鉗技術(shù)每次只能記錄一個細(xì)胞(或一對細(xì)胞),對實驗人員來說是一項耗時耗力的工作,不適合在藥物開發(fā)初期和中期進(jìn)行大量化合物的篩選,也不適合需要記錄火量細(xì)胞的基礎(chǔ)實驗研究。全自動膜片鉗技術(shù)的出現(xiàn)在很大程度上解決了這些問題,它不僅通量高,一次能記錄幾個甚至幾十個細(xì)胞,而且從找細(xì)胞、形成封接、破膜等整個實驗操作實現(xiàn)了自動化,免除了這些操作的復(fù)雜與困難。這兩個優(yōu)點使得膜片鉗技術(shù)的工作效率提高了!全自動膜片鉗技術(shù)采用的標(biāo)本必須是懸浮細(xì)胞,像腦片這類標(biāo)本無法采用。此外,全自動膜片鉗技術(shù)只能進(jìn)行全細(xì)胞記錄模式、穿孔膜片鉗記錄模式以及細(xì)胞貼附式單通道記錄模式,而不能進(jìn)行其他模式的記錄。Neher創(chuàng)膜片鉗的膜電容檢測與碳纖電極電化學(xué)檢測聯(lián)合運用的技術(shù)。高通量全自動膜片鉗哪家好
1976年德國馬普生物物理化學(xué)研究所Neher和Sakmann在青蛙肌細(xì)胞上記錄記錄到AChjihuo的單通道離子電流1980年Sigworth等用負(fù)壓吸引,得到10-100GΩ的高阻封接(Giga-sea1),降低了記錄時的噪聲1981年Hamill和Neher等引進(jìn)了膜片游離技術(shù)和全細(xì)胞記錄技術(shù)1983年10月,《Single-ChannelRecording》一書問世,奠定了膜片鉗技術(shù)的里程碑。膜片鉗技術(shù)原理膜片鉗技術(shù)是用玻璃微電極接觸細(xì)胞,形成吉歐姆(GΩ)阻抗,使得與電極前列開口處相接的細(xì)胞膜的膜片與周圍在電學(xué)上絕緣,在此基礎(chǔ)上固定電位,對此膜片上的離子通道的離子電流(pA級)進(jìn)行監(jiān)測記錄的方法。進(jìn)口腦片膜片鉗系統(tǒng)在細(xì)胞膜的電興奮過程中,脂質(zhì)層膜電容的反應(yīng)是被動的,其電流電壓曲線是線性的。
電壓鉗的原理∶用兩根前列直徑0.5um的電極插入細(xì)胞內(nèi),一根電極用作記錄電極以記錄跨膜電位,用另一根電極作為電流注入電極,以固定膜電位。從而實現(xiàn)固定膜電位的同時記錄膜電流。電位記錄電極引導(dǎo)的膜電位(Vm)輸入電壓鉗放大器的負(fù)輸入端,而人為控制的指令電位(Vc)輸入正輸入端,放大器的正負(fù)輸入端子等電位,向正輸入端子施加指令電位(Vc)時,經(jīng)過短路負(fù)端子可使膜片等電較,即Vm=Vc,從而達(dá)到電位鉗制的目的,并可維持一定的時間。Vc的不同變化將導(dǎo)致Vm的變化,從而引起細(xì)胞膜上電壓依賴性離子通道的開放,通道開放引起的離子流反過來又引起Vm的變化,致使Vm≠Vc,Vc與Vm的任何差值都會導(dǎo)致放大器有電壓輸出,將相反極性的電流注入細(xì)胞,以使Vc=Vm,注入電流的大小與跨膜離子流相等,但方向相反。因而注入的電流被認(rèn)為是標(biāo)本興奮時的跨膜電流值(通道電流)。
對電極持續(xù)施加一個1mV、10~50ms的階躍脈沖刺激,電極入水后電阻約4~6MΩ,此時在計算機屏幕顯示框中可看到測試脈沖產(chǎn)生的電流波形。開始時增益不宜設(shè)得太高,一般可在1~5mV/pA,以免放大器飽和。由于細(xì)胞外液與電極內(nèi)液之間離子成分的差異造成了液結(jié)電位,故一般電極剛?cè)胨畷r測試波形基線并不在零線上,須首先將保持電壓設(shè)置為0mV,并調(diào)節(jié)“電極失調(diào)控制“使電極直流電流接近于零。用微操縱器使電極靠近細(xì)胞,當(dāng)電極前列與細(xì)胞膜接觸時封接電阻指示Rm會有所上升,將電極稍向下壓,Rm指示會進(jìn)一步上升。通過細(xì)塑料管向電極內(nèi)稍加負(fù)壓,細(xì)胞膜特性良好時,Rm一般會在1min內(nèi)快速上升,直至形成GΩ級的高阻抗封接。一般當(dāng)Rm達(dá)到100MΩ左右時,電極前列施加輕微負(fù)電壓(-30~-10mV)有助于GΩ封接的形成。此時的現(xiàn)象是電流波形再次變得平坦,使電極超極化由-40到-90mV,有助于加速形成封接。為證實GΩ封接的形成,可以增加放大器的增益,從而可以觀察到除脈沖電壓的首尾兩端出現(xiàn)電容性脈沖前列電流之外,電流波形仍呈平坦?fàn)?。全?xì)胞膜片鉗記錄是應(yīng)用較早,也是普遍的鉗位技術(shù)。
細(xì)胞是動物和人體的基本單元,細(xì)胞與細(xì)胞內(nèi)的通信是依靠其膜上的離子通道進(jìn)行的,離子和離子通道是細(xì)胞興奮的基礎(chǔ),亦即產(chǎn)生生物電信號的基礎(chǔ),生物電信號通常用電學(xué)或電子學(xué)方法進(jìn)行測量。由此形成了一門細(xì)胞學(xué)科--電生理學(xué)。膜片鉗技術(shù)已成為研究離子通道的黃金標(biāo)準(zhǔn)。電壓門控性離子通道:膜上通道蛋白的帶點集團(tuán)在膜電位改變時,在電場的作用下,重新分布導(dǎo)致通道的關(guān)閉,同時有電荷移動,稱為門控電流。配體門控離子通道:神經(jīng)遞質(zhì)(如乙酰膽堿)、ji素等與通道蛋白上的特定位點結(jié)合,引起蛋白構(gòu)像的改變,導(dǎo)致通道的打開。由于電極前列與細(xì)胞膜的高阻封接,在電極前列籠罩下的那片膜事實上與膜的其他部分從電學(xué)上隔離。進(jìn)口雙電極膜片鉗解決方案
這是一種以記錄通過離子通道的離子電流來反映細(xì)胞膜單一的或多個的離子通道分子活動的技術(shù)。高通量全自動膜片鉗哪家好
過去認(rèn)為,膜片鉗只能在培養(yǎng)細(xì)胞或酶解的細(xì)胞上進(jìn)行,這樣得到的細(xì)胞膜表面比較光滑,才能夠形成高阻封接,但缺點是組織的正常三維結(jié)構(gòu)被破壞,并且對神經(jīng)中樞內(nèi)突觸特有的傳遞機能的研究無法展開。于是,一些學(xué)者建立了組織切片膜片鉗技術(shù)(Slicepatch),就能在哺乳動物腦片制備上做全細(xì)胞記錄。1992年,在腦片膜片鉗技術(shù)上,美國Ferster實驗室報道在在體貓的視皮層用膜片鉗全細(xì)胞記錄研究了視刺激誘發(fā)的興奮性和***性突觸后電位相互影響及節(jié)律性膜電位的變化規(guī)律。1993年,德國的Dodt和Sakmann合作,利用紅外電視顯微鏡監(jiān)視,使得膜片鉗記錄不但能夠在神經(jīng)元胞體及其樹突上進(jìn)行,而且可同時在這兩個不同的部位作膜片鉗記錄。高通量全自動膜片鉗哪家好
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