免疫沉淀技術(shù)RIP（RNA Immunoprecipitation，RNA免疫沉淀）的實驗方法基于以下幾個關(guān)鍵步驟：
1. 細(xì)胞裂解：首先，細(xì)胞或組織樣本被裂解，以釋放細(xì)胞內(nèi)的蛋白質(zhì)和RNA復(fù)合物。
2.抗體特異性結(jié)合：裂解后的樣本中加入針對特定RNA結(jié)合蛋白的抗體。這些抗體能夠特異性地識別并結(jié)合到目標(biāo)蛋白。
3. 免疫復(fù)合物形成：抗體與目標(biāo)蛋白結(jié)合后，形成抗體-蛋白質(zhì)-RNA復(fù)合物。
4. 親和介質(zhì)捕獲：使用蛋白A或蛋白G結(jié)合的珠子（如瓊脂糖或磁性珠子）來捕獲這些抗體-蛋白質(zhì)-RNA復(fù)合物。蛋白A或蛋白G能夠與抗體的Fc部分結(jié)合，從而拉下與之結(jié)合的復(fù)合物。
5. 洗滌：捕獲的復(fù)合物被洗滌以去除未特異性結(jié)合的蛋白質(zhì)和RNA。
6. RNA分離和分析：從珠子上洗脫或消化復(fù)合物，分離出RNA，并進行進一步的分析，如qPCR、Northern blot或高通量測序（RNA-Seq）。
免疫沉淀技術(shù)RIP的實驗方法。上海anti Flag免疫沉淀實驗視頻
免疫沉淀ChIP實驗中磁珠還是瓊脂糖珠的選擇取決于客戶實驗情況。
瓊脂糖珠海綿狀的結(jié)構(gòu) (直徑 50-150 μm) 可以結(jié)合抗體 (繼而結(jié)合靶蛋白) ，它能夠直接高效、快速結(jié)合抗體，而不需借助特殊的專業(yè)設(shè)備。瓊脂糖珠呈多孔結(jié)構(gòu)，這使得它們擁有更大的表面積可與蛋白質(zhì)相互接觸，具有更高的結(jié)合載量。
與瓊脂糖珠不同，磁珠是固體，抗體的結(jié)合限于磁珠的表面。磁珠 (直徑 1-4 μm) 明顯小于瓊脂糖珠 ，盡管磁珠沒有多孔中心增加結(jié)合能力，但每體積的磁珠數(shù)量比瓊脂糖珠多，使磁珠擁有足夠的抗體結(jié)合表面積滿足高容量的抗體結(jié)合。
簡而言之，瓊脂糖珠的結(jié)合能力較強，而磁珠在得率，可重復(fù)性以及自動化方面有明顯的優(yōu)勢。
溫州Protein AG免疫沉淀磁珠貨期免疫沉淀技術(shù)IP的實驗設(shè)計。
免疫沉淀是利用抗體特異性反應(yīng)純化富集目的蛋白的一種方法?？贵w與細(xì)胞裂解液或表達上清中相應(yīng)的蛋白結(jié)合后，再與蛋白A/G（ProteinA/G）或二抗偶聯(lián)的珠子（agarose或Sepharose）孵育，通過離心得到珠子-蛋白A/G或二抗-抗體-目的蛋白復(fù)合物，沉淀經(jīng)過洗滌后，重懸于電泳上樣緩沖液，煮沸5-10min，在高溫及還原劑的作用下，抗原與抗體解離，離心收集上清，上清中包括抗體、目的蛋白和少量的雜蛋白。免疫沉淀是一種生物學(xué)技術(shù)，它利用抗體的特異性結(jié)合特性來富集和分離混合物中的特定蛋白質(zhì)。這種技術(shù)是研究蛋白質(zhì)表達、蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用、蛋白質(zhì)修飾和蛋白質(zhì)功能的強大工具。
免疫沉淀技術(shù)（Immunoprecipitation, IP）是一種用于研究蛋白質(zhì)相互作用和純化特定蛋白質(zhì)的實驗方法。
優(yōu)點:
1. 特異性強：利用特異性抗體捕獲目標(biāo)蛋白，可以有效地從復(fù)雜的生物樣本中分離出感興趣的蛋白質(zhì)。
2. 靈敏度高：可以檢測到低豐度的蛋白質(zhì)，包括瞬態(tài)或弱相互作用的蛋白質(zhì)復(fù)合物。
3. 應(yīng)用范圍廣：適用于多種生物樣本，如細(xì)胞裂解物、組織提取物和生物流體。
4. 生物學(xué)洞察深入：能夠揭示蛋白質(zhì)之間的相互作用網(wǎng)絡(luò)，有助于理解細(xì)胞內(nèi)的信號傳遞和調(diào)控機制。
5. 可與其他技術(shù)聯(lián)用：如與質(zhì)譜（IP-MS）聯(lián)用，可以準(zhǔn)確鑒定蛋白質(zhì)及其相互作用伙伴。
缺點:
1. 對抗體依賴性高：需要高親和力和高特異性的抗體，抗體的質(zhì)量直接影響實驗結(jié)果。
2. 可能存在非特異性結(jié)合：樣本中的其他蛋白質(zhì)可能與抗體或固相支持物發(fā)生非特異性結(jié)合，導(dǎo)致背景噪音。
3. 可能影響蛋白質(zhì)的天然狀態(tài)：裂解和沉淀過程可能會改變蛋白質(zhì)的構(gòu)象和功能。
4. 實驗重復(fù)性：需要多次實驗來確保結(jié)果的可重復(fù)性和可靠性。
5. 樣品處理：需要避免樣品降解和非特異性結(jié)合，這可能需要使用蛋白酶抑制劑和適當(dāng)?shù)木彌_液條件。
免疫沉淀RIP抗體的選擇？
免疫共沉淀分析（Co-IP）實驗原理與IP十分類似，基本的技術(shù)都是采用目標(biāo)抗原特異性的固相化抗體；但IP的目標(biāo)是純化單一抗原，而Co-IP旨在分離抗原及與抗原結(jié)合的蛋白質(zhì)或配體。
在Co-IP實驗中，已知抗原稱為誘餌蛋白，與之結(jié)合的蛋白則稱為靶蛋白。靶蛋白可能是一些復(fù)雜的伴侶蛋白、信號分子、結(jié)構(gòu)蛋白、輔助因子等，蛋白間相互作用強度范圍可能介于高度瞬時和十分穩(wěn)定之間?；镜腃o-IP實驗方案與IP相同，實際上任何IP系統(tǒng)均可用于Co-IP。但是，還有許多其他因素需要考慮，例如，結(jié)合和洗滌條件的優(yōu)化，優(yōu)化時，需要考慮到誘餌蛋白-靶蛋白的相互作用強度以及抗體-誘餌蛋白的親和力。
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RIP技術(shù)的優(yōu)勢在于：
1. 特異性：利用特異性抗體，可以精確地捕獲目標(biāo)RNA結(jié)合蛋白及其相互作用的RNA。
2. 應(yīng)用場景多：適用于研究RNA結(jié)合蛋白、miRNA、lncRNA等非編碼RNA與蛋白質(zhì)的相互作用。
3. 技術(shù)結(jié)合：RIP后的RNA可以用于多種下游分析，如qPCR、測序等，為研究RNA的功能和調(diào)控提供了重要信息。
RIP技術(shù)的限制包括：
1. 抗體質(zhì)量：需要高質(zhì)量的特異性抗體，否則可能得到假陽性或假陰性結(jié)果。
2. 非特異性結(jié)合：可能存在非特異性結(jié)合問題，需要仔細(xì)的實驗設(shè)計和對照來控制。
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