微滴式數(shù)字PCR系統(tǒng)在傳統(tǒng)的PCR擴增前對樣品進行微滴化處理，即將含有核酸分子的反應(yīng)體系分成成千上萬個納升級的微滴，其中每個微滴或不含待檢核酸靶分子，或者含有一個至數(shù)個待檢核酸靶分子。經(jīng)PCR擴增后，逐個對每個微滴進行檢測，有熒光信號的微滴判讀為1，沒有熒光信號的微滴判讀為0，根據(jù)泊松分布原理及陽性微滴的個數(shù)與比例即可得出靶分子的起始拷貝數(shù)或濃度。

與傳統(tǒng)PCR相比所具有的優(yōu)勢

       不依賴Ct值或內(nèi)參基因，即可確定低至單拷貝的待檢靶分子的***數(shù)目。微滴技術(shù)讓數(shù)字PCR更低成本，且更實用。

可使用第三方PCR反應(yīng)液，配備PCR A300（溫度范圍4°C-98°C，擴增模塊溫控精度±0.2°C）。無錫JUE對定量數(shù)字PCR

       數(shù)字PCR可以直接計算目標序列的拷貝數(shù)，因此無需依賴于對照樣品和標準曲線就可以進行精確的***定量檢測；此外，由于數(shù)字PCR在進行結(jié)果判讀時*判斷有/無兩種擴增狀態(tài)，因此也不需要檢測熒光信號與設(shè)定閾值線的交點，完全不依賴于Ct值的鑒定，因此數(shù)字PCR的反應(yīng)受擴增效率的影響**降低，對PCR反應(yīng)***物的耐受能力**提高；數(shù)字PCR實驗中標準反應(yīng)體系分配的過程可以極大程度上降低與目標序列有競爭性作用的背景序列濃度，因此數(shù)字PCR技術(shù)也特別適合在復(fù)雜背景中檢測稀有突變。寧波國產(chǎn)數(shù)字PCR原理全封閉體系，自動化流程操作。

       在定量PCR時，我們常常糾結(jié)一個問題，究竟是相對定量還是***定量呢？如今，你無需糾結(jié)了，因為數(shù)字PCR（digital PCR）來了。盡管這兩種技術(shù)有些類似，都是估計起始樣品中的核酸量，但它們有一個重要的區(qū)別。定量PCR是依靠標準曲線或參照基因來測定核酸量，而數(shù)字PCR則讓你能夠直接數(shù)出DNA分子的個數(shù)，是對起始樣品的***定量。因此特別適用于依靠Ct值不能很好分辨的應(yīng)用領(lǐng)域：拷貝數(shù)變異、突變檢測、基因相對表達研究（如等位基因不平衡表達）、二代測序結(jié)果驗證、miRNA表達分析、單細胞基因表達分析等。

       數(shù)字PCR檢測及分析原理在上世紀90年代就被提出來了，但是無奈受限于當(dāng)時的技術(shù)條件，樣本稀釋及分配都是靠手工來完成的，受到很多因素的干擾和限制；并且結(jié)果分析對于研究者來說也十分枯燥與繁瑣，因此在很長一段時間dPCR發(fā)展停滯不前。后來由于微流控技術(shù)與微納集成制造工藝的發(fā)展解決了dPCR過程中的幾個關(guān)鍵技術(shù)問題，推動了dPCR的研究與商業(yè)化的發(fā)展。

       目前根據(jù)dPCR樣本稀釋分配的方式，基本可分為三大類，一種是基于大規(guī)模集成微流控芯片；第二種是使用微反應(yīng)室/孔板；第三種是微滴式。但不論是走芯片式還是微滴式，其基本原理都是將大量稀釋后的核酸溶液分散至芯片的微反應(yīng)器或者微滴當(dāng)中，每個反應(yīng)器的核酸模板數(shù)少于1或者等于1。經(jīng)過PCR擴增之后，有一個核酸分子的模板的反應(yīng)器就會給出熒光信號，沒有模板的反應(yīng)器沒有熒光信號。根據(jù)相對比例和反應(yīng)器的體積，可以推算出原始溶液的核酸濃度。 理論上可覆蓋qPCR（熒光定量PCR)的所有應(yīng)用。

       要了解為什么傳統(tǒng) PCR 存在限制，務(wù)必要了解 PCR 反應(yīng)過程中發(fā)生了什么?；?PCR 運行可以分為三個階段：

指數(shù)期

       每個循環(huán)積聚的產(chǎn)物準確加倍（假定 ** 反應(yīng)效率）。該反應(yīng)具有高度特異性和精確度。出現(xiàn)指數(shù)式擴增，因為所有試劑均新鮮可用，反應(yīng)的動力學(xué)推動反應(yīng)有利于擴增子加倍。

線性期（高變異性）

       隨著反應(yīng)繼續(xù)，一些試劑因擴增而被消耗。反應(yīng)開始減緩，并且每個循環(huán)的 PCR 產(chǎn)物不再加倍。

平臺期（終點：使用傳統(tǒng)方法進行凝膠檢測）

       反應(yīng)停止，不再產(chǎn)生更多產(chǎn)物，并且如果放置時間夠長，PCR 產(chǎn)物將開始降解。因為每個樣品具有不同的反應(yīng)動力學(xué)，所以每支試管或每個反應(yīng)將在不同的時間點進入平臺期。在平臺期可以看到這些差異。在平臺期內(nèi)，傳統(tǒng) PCR 進行測量，又稱為終點檢測。 準確度不完全依賴于擴增效率。廣州廣州永諾數(shù)字PCR原理

超高靈敏度，適用于稀有序列及稀有突變的檢測。無錫JUE對定量數(shù)字PCR

       數(shù)字PCR通過將一個樣本分成幾十到幾萬份，分配到不同的反應(yīng)單元（微滴），包含一個或多個拷貝的核酸分子(也就是說我們所說的 DNA 模板) ，這是與PCR或qPCR反應(yīng)比較大的區(qū)別，PCR或qPCR只在一個反應(yīng)體系中進行，而數(shù)字PCR在每個反應(yīng)單元（微滴）中都會對目標分子進行擴增，擴增結(jié)束后統(tǒng)計熒光信號并分析。是不是聽起來特別高(yi)大(lian)上(meng)？舉個栗子，PCR或qPCR檢測突變像是在大海里撈一個會發(fā)光的針，周圍都是海水，很難看到針的光在哪，而dPCR就像把海水盛到好多個碗里面，瞧一眼很容易就知道哪個碗在發(fā)光了，而且，系統(tǒng)還會數(shù)出來到底有多少個碗里是發(fā)光的，多少個碗里是沒發(fā)光的，這樣一比，不就很容易的知道有多少數(shù)量的突變，就能做到***定量了。無錫JUE對定量數(shù)字PCR

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