聚合酶鏈反應：流聚合酶鏈反應:一種偽等溫PCR方法。將溶液置于熱梯度下，而不是反復加熱和冷卻聚合酶鏈反應混合物。由此產(chǎn)生的熱不穩(wěn)定性驅(qū)動對流流動自動將聚合酶鏈反應試劑從熱區(qū)域和冷區(qū)域打亂，從而反復啟動聚合酶鏈反應。通過利用混沌流場的出現(xiàn)，可以優(yōu)化熱邊界條件和PCR外殼的幾何形狀等參數(shù)，以產(chǎn)生特異和快速的PCR。這種對流聚合酶鏈反應設(shè)置明顯降低了設(shè)備功率需求和操作時間。逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應):用于從RNA中擴增DNA。逆轉(zhuǎn)錄酶將核糖核酸逆轉(zhuǎn)錄成cDNA ，然后通過聚合酶鏈反應進行擴增。逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應較廣用于表達譜，以確定基因的表達或鑒定RNA轉(zhuǎn)錄物的序列，包括轉(zhuǎn)錄起始和終止位點。如果基因的基因組DNA序列是已知的，逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應可以用來繪制基因中外顯子和內(nèi)含子的位置。基因的5’端(對應于轉(zhuǎn)錄起始位點)通常通過 RACE-PCR (快速擴增cDNA末端)中。聚合酶鏈反應應經(jīng)常使用帶有一次性柱塞和超長移液器吸頭的移液器。徐州微量Real-time PCR服務(wù)

聚合酶鏈式反應準備：PCR所用的酶主要有兩種來源：Taq和Pfu，分別來自兩種不同的噬熱菌。其中Taq擴增效率高但易發(fā)生錯配。Pfu擴增效率弱但有糾錯功能。所以實際使用時根據(jù)需要必須做不同的選擇。模板即擴增用的DNA，可以是任何來源，但有兩個原則，純度必須較高，第二濃度不能太高以免抑制。緩沖液的成分很為復雜，除水外一般包括四個有效成分：緩沖體系，一般使用HEPES或MOPS緩沖體系；一價陽離子，一般采用鉀離子，但在特殊情況下也可使用銨根離子；二價陽離子，即鎂離子，根據(jù)反應體系確定，除特殊情況外不需調(diào)整；輔助成分，常見的有DMSO、甘油等，主要用來保持酶的活性和幫助DNA解除纏繞結(jié)構(gòu)。南京微量Real-time PCR網(wǎng)站嵌套聚合酶鏈反應：通過減少DNA非特異性擴增的背景，提高DNA擴增的特異性。

聚合酶鏈反應的常見問題分析與解決方法：擴增產(chǎn)物出現(xiàn)多條帶(雜帶)：引物用量偏大，引物的特異性不高。應調(diào)換引物或降低引物的使用量。循環(huán)的次數(shù)過多。適當增加模板的量，減少循環(huán)次數(shù)。酶的用量偏高或酶的質(zhì)量不好，應降低酶量或調(diào)換另一來源的酶。退火溫度偏低，退火及延伸時間偏長。應提高退火溫度，減少變性與延伸時間，也可采用二種溫度的PCR擴增。以2度為梯度設(shè)計梯度PCR反應優(yōu)化退火溫度。 樣品處理不當。Mg2+濃度偏高，因適當調(diào)整Mg2+使用濃度。若為PCR試劑盒，也可能時試劑盒本身質(zhì)量有問題。復制提前終止。使用非熱啟動的聚合酶時常有發(fā)生。冰上準備反應體系或采用熱啟動聚合酶。

聚合酶鏈式反應又稱多聚酶鏈式反應，是一項利用DNA雙鏈復制的原理，在生物體外復制特定DN段的核酸合成技術(shù)。透過這項技術(shù)，可在短時間內(nèi)大量擴增目的基因，而不必依賴大腸桿菌或酵母菌等生物體。聚合酶鏈反應是是一種簡單，廉價和可靠的方法復制DN段，這個概念適用于現(xiàn)物學和相關(guān)科學的許多領(lǐng)域。 PCR可能是分子生物學中使用很較廣的技術(shù)。這種技術(shù)被用于生物醫(yī)學研究，犯罪取證和分子考古學。通常，PCR由一系列20-40次重復的溫度變化組成，稱為熱循環(huán)，每個循環(huán)通常由兩個或三個離散的溫度步驟組成。聚合酶鏈式反應的特異性依賴于與靶序列兩端互補的寡核苷酸引物。

聚合酶鏈反應的常見問題分析與解決方法：無擴增條帶：酶失活或在反應體系中未加入酶。Taq DNA聚合酶因保存或運輸不當而失活，往往通過更換新酶或用另一來源的酶以獲得滿意的結(jié)果。模板含有雜質(zhì)。特別是對甲醛固定及石蠟包埋的組織常含甲酸，造成DNA脫嘌呤而影響PCR的結(jié)果。變性溫度是否準確：PCR儀指示溫度與實際溫度是否相符，過高酶在前幾個循環(huán)就迅速失活；過低則模板變性不徹底。反應系統(tǒng)中污染了蛋白酶及核酸酶，應在未加Taq酶以前，將反應體系95℃加熱5-10 min。引物變質(zhì)失效。人工合成的引物是否正確。是否純化，或因儲存條件不當而失活。引物錯誤。利用BLAST檢查引物特異性或重新設(shè)計引物。 DNA凝膠電泳時加入陽性對照，確保不是DNA凝膠和PCR程序的問題。電子聚合酶鏈反應用于計算理論聚合酶鏈反應結(jié)果。寧波實時RT-PCR檢測技術(shù)技術(shù)服務(wù)

逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應較廣用于表達譜，以確定基因的表達或鑒定RNA轉(zhuǎn)錄物的序列。徐州微量Real-time PCR服務(wù)

聚合酶鏈式反應的特點：特異性強，PCR反應的特異性決定因素為：引物與模板DNA特異正確的結(jié)合；堿基配對原則；Taq DNA聚合酶合成反應的忠實性；靶基因的特異性與保守性。其中引物與模板的正確結(jié)合是關(guān)鍵。引物與模板的結(jié)合及引物鏈的延伸是遵循堿基配對原則的。聚合酶合成反應的忠實性及TaqDNA聚合酶耐高溫性，使反應中模板與引物的結(jié)合（復性）可以在較高的溫度下進行，結(jié)合的特異性增加，被擴增的靶基因片段也就能保持很高的正確度。再通過選擇特異性和保守性高的靶基因區(qū)，其特異性程度就更高。徐州微量Real-time PCR服務(wù)