聚合酶鏈式反應(yīng)的常見問題:出現(xiàn)非特異性擴增帶:PCR擴增后出現(xiàn)的條帶與預計的大小不一致,或大或小,或者同時出現(xiàn)特異性擴增帶 與非特異性擴增帶。非特異性條帶的出現(xiàn),其原因:一是引物與靶序列不完全互補、或引物聚合形成二聚體。二是Mg2+離子濃度過高、退火溫度過低,及PCR循環(huán)次數(shù)過多有關(guān)。其次是酶的質(zhì)和量,往往一些來源的酶易出現(xiàn)非特異條帶而另一來源的酶則不出現(xiàn),酶量過多有時也會出現(xiàn)非特異性擴增。其對策有:必要時重新設(shè)計引 物。減低酶量或調(diào)換另一來源的酶。降低引物量,適當增加模板量,減少循環(huán)次數(shù)。適當提高退火溫度或采用二溫度點法(93℃變性,65℃左右退火與延伸)。PCR的很大特點是能將微量的DNA大幅增加。莆田骨頭RT-PCR檢測技術(shù)網(wǎng)站
聚合酶鏈式反應(yīng)PCR技術(shù)的基本原理類似于DNA的天然復制過程,其特異性依賴于與靶序列兩端互補的寡核苷酸引物。PCR由變性-退火-延伸三個基本反應(yīng)步驟構(gòu)成:模板DNA的變性:模板DNA經(jīng)加熱至93℃左右一定時間后,使模板DNA雙鏈或經(jīng)PCR擴增形成的雙鏈DNA解離,使之成為單鏈,以便它與引物結(jié)合,為下輪反應(yīng)作準備;模板DNA與引物的退火(復性):模板DNA經(jīng)加熱變性成單鏈后,溫度降至55℃左右,引物與模板DNA單鏈的互補序列配對結(jié)合;引物的延伸:DNA模板-引物結(jié)合物在72℃、DNA聚合酶(如TaqDNA聚合酶)的作用下,以dNTP為反應(yīng)原料,靶序列為模板,按堿基互補配對與半保留復制原理,合成一條新的與模板DNA鏈互補的半保留復制鏈,重復循環(huán)變性-退火-延伸三過程就可獲得更多的“半保留復制鏈”,而且這種新鏈又可成為下次循環(huán)的模板。每完成一個循環(huán)需2~4分鐘,2~3小時就能將待擴目的基因擴增放大幾百萬倍。廈門實時PCR檢測技術(shù)技術(shù)服務(wù)在嵌套聚合酶鏈反應(yīng)中,除了預期的靶之外,該產(chǎn)物可能仍然由非特異性擴增的DN段組成。
聚合酶鏈反應(yīng):熱啟動聚合酶鏈式反應(yīng):一種在PCR的初始建立階段減少非特異性擴增的技術(shù)。它可以通過將反應(yīng)組分加熱到變性溫度(例如95 c)在加入聚合酶。[36]已經(jīng)開發(fā)了特殊的酶系統(tǒng),通過結(jié)合抗體來抑制聚合酶在環(huán)境溫度下的活性[37][37]或者通過共價鍵結(jié)合的抑制劑的存在,該抑制劑在高溫活化步驟后解離。熱啟動/冷完成聚合酶鏈反應(yīng)是通過新的雜合聚合酶實現(xiàn)的,這些酶在環(huán)境溫度下不活躍,在伸長溫度下立即。序列間特異性聚合酶鏈反應(yīng)(ISSR):一種用于DNA指紋識別的聚合酶鏈反應(yīng)方法,它放大簡單重復序列之間的區(qū)域,以產(chǎn)生擴增片段長度的獨特指紋。電子聚合酶鏈反應(yīng)(數(shù)字聚合酶鏈反應(yīng)、虛擬聚合酶鏈反應(yīng)、電子聚合酶鏈反應(yīng)、電子聚合酶鏈反應(yīng))是指計算工具使用給定的一組引物 ( 探針)來擴增來自測序的基因組或轉(zhuǎn)錄組的DNA 序列,用于計算理論聚合酶鏈反應(yīng)結(jié)果。電子PCR被提出作為分子生物學的教育工具。
聚合酶鏈式:PCR由變性--退火--延伸三個基本反應(yīng)步驟構(gòu)成:模板DNA的變性:模板DNA經(jīng)加熱至93℃左右一定時間后,使模板DNA雙鏈或經(jīng)PCR擴增形成的雙鏈DNA解離,使之成為單鏈,以便它與引物結(jié)合,為下輪反應(yīng)作準備;模板DNA與引物的退火(復性):模板DNA經(jīng)加熱變性成單鏈后,溫度降至55℃左右,引物與模板DNA單鏈的互補序列配對結(jié)合;引物的延伸:DNA模板--引物結(jié)合物在TaqDNA聚合酶的作用下,以dNTP為反應(yīng)原料,靶序列為模板,按堿基配對與半保留復制原理,合成一條新的與模板DNA 鏈互補的半保留復制鏈重復循環(huán)變性--退火--延伸三過程,就可獲得更多的“半保留復制鏈”,而且這種新鏈又可成為下次循環(huán)的模板。每完成一個循環(huán)需2-4分鐘,2-3小時就能將待擴目的基因擴增放大幾百萬倍。到達平臺期(Plateau)所需循環(huán)次數(shù)取決于樣品中模板的拷貝?!CR技術(shù)敏感性高,特異性強,操作簡便、快速,在生命科學研究、食品衛(wèi)生、醫(yī)療、法醫(yī)及環(huán)境監(jiān)測等諸多方面都具有重要的應(yīng)用價值。聚合酶鏈式反應(yīng)準備:引物內(nèi)部不應(yīng)出現(xiàn)互補序列。
現(xiàn)在有些PCR因為擴增區(qū)很短,即使Taq酶活性不是很好也能在很短的時間內(nèi)復制完成,因此可以改為兩步法,即退火和延伸同時在60℃-65℃間進行,以減少一次升降溫過程,提高了反應(yīng)速度。檢測:PCR反應(yīng)擴增出了高的拷貝數(shù),下一步檢測就成了關(guān)鍵。熒光素(溴化乙錠,EB)染色凝膠電泳是很常用的檢測手段。電泳法檢測特異性是不太高的,因此引物兩聚體等非特異性的雜交體很容易引起誤判。但因為其簡捷易行,成為了主流檢測方法。近年來以熒光探針為的檢測方法,有逐漸取代電泳法的趨勢。逆轉(zhuǎn)錄酶將核糖核酸逆轉(zhuǎn)錄成cDNA ,然后通過聚合酶鏈反應(yīng)進行擴增。杭州細胞熒光PCR方案
聚合酶鏈反應(yīng)應(yīng)經(jīng)常使用帶有一次性柱塞和超長移液器吸頭的移液器。莆田骨頭RT-PCR檢測技術(shù)網(wǎng)站
聚合酶鏈式反應(yīng):反應(yīng)的控制:PCR反應(yīng)的緩沖液 提供合適的酸堿度與某些離子;鎂離子濃度 總量應(yīng)比dNTPs的濃度高,常用1.5mmol/L;底物濃度 dNTP以等摩爾濃度配制,20~200umol/L;TaqDNA聚合酶 2.5U(100ul);引物濃度一般為0.1 ~ 0.5umol/L;反應(yīng)溫度和循環(huán)次數(shù);變性溫度和時間 95℃,30s;退火溫度和時間 低于引物Tm值5 ℃左右,一般在45~55℃;延伸溫度和時間 72℃,1min/kb(10kb內(nèi));Tm值=4(G+C) +2(A+T);循環(huán)次數(shù) :一般為25 ~ 30次。循環(huán)數(shù)決定PCR擴增的產(chǎn)量。模板初始濃度低,可增加循環(huán)數(shù)以便達到有效的 擴增量。但循環(huán)數(shù)并不是可以無限增加的。一般循環(huán)數(shù)為30個左右,循環(huán)數(shù)超過30個以后,DNA聚合酶活性逐漸達到飽和,產(chǎn)物的量不再隨循環(huán)數(shù)的增加而增加,出現(xiàn)了所謂的“平臺期”。莆田骨頭RT-PCR檢測技術(shù)網(wǎng)站