聚合酶鏈式反應(yīng)：模板的制備，PCR的模板可以是DNA，也可以是RNA。模板的取材主要依據(jù)PCR的擴增對象，可以是病原體標本如病毒、細菌、菌類等。也可以是病理生理標本如細胞、血液、羊水細胞等。法醫(yī)學(xué)標本有血斑、精斑、毛發(fā)等。標本處理的基本要求是除去雜質(zhì)，并部分純化標本中的核酸。多數(shù)樣品需要經(jīng)過SDS和蛋白酶K處理。難以破碎的細菌，可用溶菌酶加EDTA處理。所得到的粗制DNA，經(jīng)酚、氯仿抽提純化，再用乙醇沉淀后用作PCR反應(yīng)模板。流聚合酶鏈反應(yīng)：一種偽等溫PCR方法。珠海實時RT-PCR檢測技術(shù)網(wǎng)站

聚合酶鏈式反應(yīng)準備：PCR所用的酶主要有兩種來源：Taq和Pfu，分別來自兩種不同的噬熱菌。其中Taq擴增效率高但易發(fā)生錯配。Pfu擴增效率弱但有糾錯功能。所以實際使用時根據(jù)需要必須做不同的選擇。模板即擴增用的DNA，可以是任何來源，但有兩個原則，純度必須較高，第二濃度不能太高以免抑制。緩沖液的成分很為復(fù)雜，除水外一般包括四個有效成分：緩沖體系，一般使用HEPES或MOPS緩沖體系；一價陽離子，一般采用鉀離子，但在特殊情況下也可使用銨根離子；二價陽離子，即鎂離子，根據(jù)反應(yīng)體系確定，除特殊情況外不需調(diào)整；輔助成分，常見的有DMSO、甘油等，主要用來保持酶的活性和幫助DNA解除纏繞結(jié)構(gòu)。徐州分子生物學(xué)RT-PCR檢測技術(shù)重疊延伸聚合酶鏈反應(yīng)用于連接含有基因、調(diào)節(jié)序列或突變的DN段。

聚合酶鏈式反應(yīng)的常見問題：Mg2+濃度：Mg2+離子濃度對PCR擴增效率影響很大，濃度過高可降低PCR擴增的特 異性，濃度過低則影響PCR擴增產(chǎn)量甚至使PCR擴增失敗而不出擴增條帶。反應(yīng)體積的改變：通常進行PCR擴增采用的體積為20ul、30ul、50ul?；?00ul，應(yīng)用多 大體積進行PCR擴增，是根據(jù)科研和臨床檢測不同目的而設(shè)定，在做小體積如20ul 后，再做大體積時，一定要模索條件，否則容易失敗。物理原因：變性對PCR擴增來說相當重要，如變性溫度低，變性時間短，極有可能出現(xiàn)假陰性；退火溫度過低，可致非特異性擴增而降低特異性擴增效率退火溫度過高影響引物與模板的結(jié)合而降低PCR擴增效率。有時還有必要用標準的溫度計，檢測一下擴增儀或水溶鍋內(nèi)的變性、退火和延伸溫度，這也是PCR失敗的原因之一。

序列標簽站點是一個過程，其中PCR被用作基因組的特定片段存在于特定克隆中的指示物。人類基因組計劃發(fā)現(xiàn)這一應(yīng)用對于繪制他們測序的粘粒克隆以及協(xié)調(diào)不同實驗室的結(jié)果至關(guān)重要。聚合酶鏈反應(yīng)的一個令人興奮的應(yīng)用是對來自遠古來源的DNA進行系統(tǒng)進化分析，例如在尼安德特人的復(fù)原骨骼中、從猛犸的冷凍組織中或從埃及木乃伊的大腦中發(fā)現(xiàn)的DNA已經(jīng)被放大和測序。]在某些情況下，這些來源的高度降解的DNA可能在擴增的早期階段重新組裝。聚合酶鏈反應(yīng)的一個常見應(yīng)用是對以下基因表達模式的研究。組織(甚至單個細胞)可以在不同階段進行分析，以了解哪些基因變得活躍，哪些基因被關(guān)閉。該應(yīng)用還可以使用定量聚合酶鏈反應(yīng)來定量表達的實際水平。聚合酶鏈反應(yīng)是一種非常強大和實用的研究工具。

聚合酶鏈式反應(yīng)：1976年，中國科學(xué)家，發(fā)現(xiàn)了穩(wěn)定的Taq DNA聚合酶，為PCR技術(shù)發(fā)展也做出了基礎(chǔ)性貢獻。PCR是利用DNA在體外攝氏95°高溫時變性會變成單鏈，低溫（經(jīng)常是60°C左右）時引物與單鏈按堿基互補配對的原則結(jié)合，標本核酸模板在提取過程中，由于吸樣污染導(dǎo)致標本間污染；有些微生物標本尤其是病毒可隨氣溶膠或形成氣溶膠而擴散再調(diào)溫度至DNA聚合酶很適反應(yīng)溫度（72°C左右），DNA聚合酶沿著磷酸到五碳糖(5'-3')的方向合成互補鏈?；诰酆厦钢圃斓腜CR儀實際就是一個溫控設(shè)備，能在變性溫度，復(fù)性溫度，延伸溫度之間很好地進行控制。聚合酶鏈反應(yīng)的試劑應(yīng)分配到一次性的等分試樣中。徐州細胞PCR檢測技術(shù)方案

聚合酶鏈式反應(yīng)的引物與模板的結(jié)合及引物鏈的延伸是遵循堿基配對原則的。珠海實時RT-PCR檢測技術(shù)網(wǎng)站

聚合酶鏈式反應(yīng)的試驗污染：實驗室中克隆質(zhì)粒的污染：在分子生物學(xué)實驗室及某些用克隆質(zhì)粒做陽性對照的檢驗室，這個問題也比較常見。因為克隆質(zhì)粒在單位容積內(nèi)含量相當高，另外在純化過程中需用較多的用具及試劑，而且在活細胞內(nèi)的質(zhì)粒，由于活細胞的生長繁殖的簡便性及具有很強的生命力。其污染可能性也很大。污染的監(jiān)測：一個好的實驗室，要時刻注意污染的監(jiān)測，考慮有無污染是什么原因造成的污染，以便采取措施，防止和消除污染。重復(fù)性試驗。選擇不同區(qū)域的引物進行PCR擴增。珠海實時RT-PCR檢測技術(shù)網(wǎng)站