聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)是一種用于放大擴(kuò)增特定的DN段的分子生物學(xué)技術(shù),它可看作是生物體外的特殊DNA復(fù)制,PCR的很大特點(diǎn)是能將微量的DNA大幅增加。因此,無論是化石中的古生物、歷史人物的殘骸,還是幾十年前兇殺案中兇手所遺留的毛發(fā)、皮膚或血液,只要能分離出一丁點(diǎn)的DNA,就能用PCR加以放大,進(jìn)行比對(duì)。這也是“微量證據(jù)”的威力之所在。由1983年美國(guó)首先提出設(shè)想,1985年由其發(fā)明了聚合酶鏈反應(yīng),即簡(jiǎn)易DNA擴(kuò)增法,意味著PCR技術(shù)的真正誕生。到2013年,PCR已發(fā)展到第三代技術(shù)。重疊延伸聚合酶鏈反應(yīng)用于連接含有基因、調(diào)節(jié)序列或突變的DN段。徐州微量數(shù)字PCR哪家好
聚合酶鏈反應(yīng):熱啟動(dòng)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng):一種在PCR的初始建立階段減少非特異性擴(kuò)增的技術(shù)。它可以通過將反應(yīng)組分加熱到變性溫度(例如95 c)在加入聚合酶。[36]已經(jīng)開發(fā)了特殊的酶系統(tǒng),通過結(jié)合抗體來抑制聚合酶在環(huán)境溫度下的活性[37][37]或者通過共價(jià)鍵結(jié)合的抑制劑的存在,該抑制劑在高溫活化步驟后解離。熱啟動(dòng)/冷完成聚合酶鏈反應(yīng)是通過新的雜合聚合酶實(shí)現(xiàn)的,這些酶在環(huán)境溫度下不活躍,在伸長(zhǎng)溫度下立即。序列間特異性聚合酶鏈反應(yīng)(ISSR):一種用于DNA指紋識(shí)別的聚合酶鏈反應(yīng)方法,它放大簡(jiǎn)單重復(fù)序列之間的區(qū)域,以產(chǎn)生擴(kuò)增片段長(zhǎng)度的獨(dú)特指紋。電子聚合酶鏈反應(yīng)(數(shù)字聚合酶鏈反應(yīng)、虛擬聚合酶鏈反應(yīng)、電子聚合酶鏈反應(yīng)、電子聚合酶鏈反應(yīng))是指計(jì)算工具使用給定的一組引物 ( 探針)來擴(kuò)增來自測(cè)序的基因組或轉(zhuǎn)錄組的DNA 序列,用于計(jì)算理論聚合酶鏈反應(yīng)結(jié)果。電子PCR被提出作為分子生物學(xué)的教育工具。武漢組織定量PCR方案重疊延伸聚合酶鏈反應(yīng)可以將缺失、插入或點(diǎn)突變引入DNA序列。
聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)準(zhǔn)備:PCR所用的酶主要有兩種來源:Taq和Pfu,分別來自兩種不同的噬熱菌。其中Taq擴(kuò)增效率高但易發(fā)生錯(cuò)配。Pfu擴(kuò)增效率弱但有糾錯(cuò)功能。所以實(shí)際使用時(shí)根據(jù)需要必須做不同的選擇。模板即擴(kuò)增用的DNA,可以是任何來源,但有兩個(gè)原則,純度必須較高,第二濃度不能太高以免抑制。緩沖液的成分很為復(fù)雜,除水外一般包括四個(gè)有效成分:緩沖體系,一般使用HEPES或MOPS緩沖體系;一價(jià)陽離子,一般采用鉀離子,但在特殊情況下也可使用銨根離子;二價(jià)陽離子,即鎂離子,根據(jù)反應(yīng)體系確定,除特殊情況外不需調(diào)整;輔助成分,常見的有DMSO、甘油等,主要用來保持酶的活性和幫助DNA解除纏繞結(jié)構(gòu)。
聚合酶鏈反應(yīng)的常見問題分析與解決方法:無擴(kuò)增條帶:酶失活或在反應(yīng)體系中未加入酶。Taq DNA聚合酶因保存或運(yùn)輸不當(dāng)而失活,往往通過更換新酶或用另一來源的酶以獲得滿意的結(jié)果。模板含有雜質(zhì)。特別是對(duì)甲醛固定及石蠟包埋的組織常含甲酸,造成DNA脫嘌呤而影響PCR的結(jié)果。變性溫度是否準(zhǔn)確:PCR儀指示溫度與實(shí)際溫度是否相符,過高酶在前幾個(gè)循環(huán)就迅速失活;過低則模板變性不徹底。反應(yīng)系統(tǒng)中污染了蛋白酶及核酸酶,應(yīng)在未加Taq酶以前,將反應(yīng)體系95℃加熱5-10 min。引物變質(zhì)失效。人工合成的引物是否正確。是否純化,或因儲(chǔ)存條件不當(dāng)而失活。引物錯(cuò)誤。利用BLAST檢查引物特異性或重新設(shè)計(jì)引物。 DNA凝膠電泳時(shí)加入陽性對(duì)照,確保不是DNA凝膠和PCR程序的問題。聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)準(zhǔn)備:PCR所用的酶主要有兩種來源:Taq和Pfu,分別來自兩種不同的噬熱菌。
聚合酶鏈反應(yīng)的常見問題分析與解決方法:反應(yīng)緩沖液未完全融化或未充分混勻。確保反應(yīng)緩沖液融化完全并徹底混勻。引物特異性差。利用BLAST檢查引物特異性或重新設(shè)計(jì)引物。引物量過多。減少反應(yīng)體系中引物的用量。模板量過多。質(zhì)粒DNA的用量應(yīng)<50ng,而基因組DNA則應(yīng)<200ng。外源DNA污染。確保操作的潔凈。陰性對(duì)照出現(xiàn)條帶:試劑,頭,工作臺(tái)污染。使用全新的試劑和頭,對(duì)工作臺(tái)進(jìn)行清潔。條帶大小與理論不符:污染。使用全新的試劑和頭,對(duì)工作臺(tái)進(jìn)行清潔。模板或引物使用錯(cuò)誤。更換引物和模板。基因亞型。對(duì)研究的基因進(jìn)行序列分析和BLAST研究。聚合酶鏈反應(yīng)應(yīng)經(jīng)常使用帶有一次性柱塞和超長(zhǎng)移液器吸頭的移液器。珠海血液PCR檢測(cè)技術(shù)原理及步驟
聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)中要確保反應(yīng)緩沖液融化完全并徹底混勻。徐州微量數(shù)字PCR哪家好
絕大多數(shù)聚合酶鏈反應(yīng)方法依賴于熱循環(huán)。熱循環(huán)將反應(yīng)物暴露于加熱和冷卻的重復(fù)循環(huán)中,以允許不同的溫度依賴性反應(yīng)——具體地說,脫氧核糖核酸融化和酶-驅(qū)動(dòng)DNA復(fù)制。聚合酶鏈反應(yīng)使用兩種主要試劑-引物(引物是短的單鏈DN段,稱為寡核苷酸,是目標(biāo)DNA區(qū)域的互補(bǔ)序列)和DNA聚合酶。在PCR反應(yīng)的步,DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)的兩條鏈在高溫下物理分離,這個(gè)過程稱為脫氧核糖核酸變性。第二步,降低溫度,引物與互補(bǔ)的脫氧核糖核酸序列結(jié)合。這兩條DNA鏈就變成了模板,以酶促的方式從構(gòu)成DNA的自由核苷酸中組裝出一條新的DNA鏈。隨著聚合酶鏈反應(yīng)的進(jìn)行,產(chǎn)生的DNA本身被用作復(fù)制的模板,啟動(dòng)了一個(gè)連鎖反應(yīng),原始的DNA模板是以指數(shù)形式放大。徐州微量數(shù)字PCR哪家好