冷凍電鏡技術原理之電子斷層掃描成像技術：通過在顯微鏡內(nèi)傾轉樣品從而收集樣品多角度的電子顯微圖像并對這些電子顯微圖像根據(jù)傾轉幾何關系進行重構的方法稱為電子斷層掃描成像技術。該方法主要應用于細胞及亞細胞器，以及沒有固定結構的生物大分子復合物(分子量范圍為800kD)，Zgao分辨率約2nm。冷凍電鏡的分類：目前我們討論的冷凍電鏡基本上指的都是冷凍透射電鏡，但是如果我們以使用冷凍技術的角度定義冷凍電鏡的話，冷凍電鏡主要可以分為冷凍透射電鏡、冷凍掃描電鏡、冷凍蝕刻電子顯微鏡。冷凍電鏡技術的基本原理是將生物大分子溶液置于電鏡載網(wǎng)上形成一層非常薄的水膜。十堰透射電鏡技術原理

冷凍電鏡技術總結：電子斷層成像技術則可用來研究一定厚度的亞細胞器在天然狀態(tài)下的內(nèi)部結構，由于樣品厚度的限制，能看到500-1000nm左右厚度的結構，的也可以了解整個細胞不同層面的內(nèi)部結構.盡管，我們能夠預言按目前電子冷凍斷層成像技術的發(fā)展會得到許多更誘人的信息。細胞內(nèi)存在大量分子機器和生物大分子復合物，并且與單個超分子相比要大，更容易對其進行識別。這樣的事實使斷層技術的目標變得簡單了。在不久的將來關于細胞骨架，核孔復合體和核纖層，囊泡聚集和運輸復合物以及其他一些細胞成分的一些基本問題會得到更清晰的闡釋。這兩種方法都不需要對樣品進行結晶，快速含水冰凍的制樣過程既不復雜，又保存了樣品的瞬時天然結構，有利于對復合物的功能進行研究，圖像自動化篩選過程將是今后提高分辨率的關鍵環(huán)節(jié)。而電子晶體學則對具有對稱結構的樣品進行三維重構具有很大的優(yōu)勢，比如二十面體病毒，螺旋對稱結構等，尤其適合膜蛋白的三維結構，并且是電子顯微術中目前只一能達到原子分辨率水平的方法?；茨仙锢鋬鐾干潆娮语@微鏡技術應用冷凍電鏡技術助力快速、高效的新藥研發(fā)。

冷凍電子顯微技術主要包括單顆粒冷凍電鏡技術和冷凍電子斷層掃描技術。單顆粒冷凍電鏡技術首先捕獲大量隨機分布的同一種生物樣品的二維圖像，然后通過圖像處理算法解析其三維結構。近年來，隨著冷凍電鏡設備和計算機軟硬件的快速發(fā)展，特別是隨著直接電子探測器在冷凍電鏡中的應用，單顆粒冷凍電鏡技術邁進了原子分辨率水平，在生物學、醫(yī)學和新藥研發(fā)等領域發(fā)揮著越來越重要的作用。冷凍電鏡通過記錄單個生物樣品在傾斜旋轉過程中投影的一系列二維圖像，采用特殊的算法計算，將二維圖像重構為三維斷層圖像。冷凍電鏡主要研究組織、細胞和微生物中的超微結構，它能夠提供生理環(huán)境下大分子復合物納米、亞納米甚至近原子尺度的原位結構信息以及其與其它大分子的相互作用信息。

冷凍電子顯微鏡技術在20世紀70年代時提出，經(jīng)過近10年的努力，在80年代趨于成熟，近年來已經(jīng)進入了快速發(fā)展的時期。它的研究對象非常普遍，包括病毒、蛋白、肌絲、蛋白質(zhì)核昔酸復合體、亞細胞器等。一方面，冷凍電微鏡技術所研究的生物樣品既可以是具有二維晶體結構的，也可以是非晶體的;而且對于樣品的分子量沒有限制。因此，很大程度突破了X-射線晶體學只能研究三維晶體樣品和核磁共振波譜學只能研究小分子量(小于100KD)樣品的限制。另一方面，生物樣品是通過快速冷凍的方法進行固定的，克了因化服學固定、染色、金屬鍍膜等過程對樣品構象的影響，更加接近樣品的生活狀態(tài)。冷凍電鏡技術就是在傳統(tǒng)透射電子顯微鏡之上，加上了低溫傳輸系統(tǒng)和冷凍防污染系統(tǒng)。

單顆粒冷凍電鏡技術的顆粒挑選：接下來需要從原始數(shù)據(jù)中篩選出顆粒投影，也被稱為“顆粒挑選”，顆粒挑選的好壞也將影響所有后續(xù)的分析和處理過程，是一個重要并且繁瑣的步驟。顆粒挑選方式可以分為手動挑選、半自動挑選和完全自動挑選這幾種。在早期的分析中，對于結構的了解還非常少，優(yōu)先考慮的都是人工挑選。但是自動的顆粒圖像獲取方法的出現(xiàn)使得在很短時間內(nèi)可以收集數(shù)十萬張顆粒圖像，人工挑選大量的顆粒圖像不太現(xiàn)實，并且人工的挑選通常會過于集中于某一類顆粒圖像，導致遺漏和偏差。半自動和全自動的方法主要有以下三類：(1)通過例如降噪、反襯增強、邊緣算子等圖像形態(tài)學方法搜索區(qū)域，基于數(shù)字圖像處理學的原理，將顆粒圖像與背景分離開來。(2)基于模板的方法，通過掃描數(shù)據(jù)圖像和已知的模板比較來挑選出潛在的顆粒圖像，模板的來源通常為手動選出的數(shù)據(jù)圖像中較為清晰的顆粒圖像，或者是已知結構的投影。(3)結合無模板和有模板的方法，通過一些有監(jiān)督的機器學習算法進行顆粒挑選。冷凍電鏡技術測定結構的幾種方法：X射線晶體學、NMR、和冷凍電鏡技術。韶關低溫電子顯微鏡技術服務電話

冷凍電鏡技術之冷凍蝕刻電子顯微鏡優(yōu)點：樣品通過冷凍，可使其微細結構接近于活的狀態(tài)。十堰透射電鏡技術原理

單顆粒冷凍電鏡技術二維圖像分析——顆粒圖像的匹配與分類：二維顆粒圖像的分類是獲取三維結構過程的第一步。對二維圖像的分析包括兩部分：顆粒圖像的匹配和顆粒圖像的分類。匹配的過程通常會對顆粒圖像應用一些變換操作，通過關聯(lián)函數(shù)去判斷不同顆粒圖像之間的相似程度。圖像匹配的算法主要分為兩種，即不依賴模型的方法和基于模型的方法，取決于是否存在利用樣本先驗信息得到的模板。隨著圖像匹配的完成，顆粒圖像需要進行分類。主要利用多元統(tǒng)計分析和主成分分析方法等算法，其他流行的二維顆粒分類技術還有神經(jīng)網(wǎng)絡分類，將圖像在二維空間自組織映射(self-organisingmapping，SOM)再進行分類和排序。二維圖像分析的目的是，首先通過圖像匹配消除旋轉和平移的誤差，利用類內(nèi)緊致、類間離散的原則進行圖像分類，較終可以對類內(nèi)顆粒圖像進行平均，提高信噪比，從而實現(xiàn)對高分辨率三維結構的構建。十堰透射電鏡技術原理

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