單顆粒冷凍電鏡技術(shù):生物大分子快速冷凍后,在低溫下利用透射電子顯微鏡對(duì)結(jié)構(gòu)均一、分散的全同樣品顆粒進(jìn)行成像,再經(jīng)圖像處理及重構(gòu)計(jì)算獲得樣品的三維結(jié)構(gòu)。可研究生物大分子在溶液中的結(jié)構(gòu)及構(gòu)象變化、無需結(jié)晶、所需樣品量相對(duì)較少,適合于蛋白質(zhì)、病毒等生物大分子及其復(fù)合物的結(jié)構(gòu)生物學(xué)研究。樣品制備:可以根據(jù)樣品、電鏡載網(wǎng)和其他使用條件,摸索合適的單顆粒樣品制備條件,純化、收集濃度范圍從幾微升50nM至5uM濃度的蛋白溶液來制備單顆粒電鏡樣品。在-196℃時(shí),組織中的生物大分子能夠長期保持穩(wěn)定性、細(xì)胞活性及組織微觀結(jié)構(gòu),同時(shí),在低溫下,生物樣品耐受電子輻照劑量增強(qiáng),且其在電鏡鏡筒的高真空環(huán)境中脫水變形的問題也得以解決。Vitrobot和EMGP2均能夠提供快速、簡單、可重復(fù)的安自動(dòng)化樣品玻璃化制備過程,其在恒定的物理和機(jī)械條件下(如溫度、相對(duì)濕度、吸濕條件和冷凍速度)對(duì)樣品進(jìn)行冷凍固定確保生物樣品在低溫狀態(tài)下仍保持天然構(gòu)象。冷凍電鏡技術(shù)之冷凍蝕刻電子顯微鏡優(yōu)點(diǎn):樣品經(jīng)冷凍斷裂蝕刻后,能夠觀察到不同劈裂面的微細(xì)結(jié)構(gòu)。黃石低溫透射電鏡技術(shù)
冷凍電鏡技術(shù)的原理:冷凍電子顯微學(xué)解析生物大分子及細(xì)胞結(jié)構(gòu)的中心是透射電鏡成像,其基本過程包括樣品制備、透射電鏡成像、圖像處理及結(jié)構(gòu)解析等幾個(gè)基本步驟。在透射電鏡成像中,電子槍產(chǎn)生的電子在高壓電場(chǎng)中被加速至亞光速并在高真空的顯微鏡內(nèi)部運(yùn)動(dòng),根據(jù)高速運(yùn)動(dòng)的電子在磁場(chǎng)中發(fā)生偏轉(zhuǎn)的原理,透射電鏡中的一系列電磁透鏡對(duì)電子進(jìn)行匯聚,并對(duì)穿透樣品過程中與樣品發(fā)生相互作用的電子進(jìn)行聚焦成像以及放大,Z后在記錄介質(zhì)上形成樣品放大幾千倍至幾十萬倍的圖像,利用計(jì)算機(jī)對(duì)這些放大的圖像進(jìn)行處理分析即可獲得樣品的精細(xì)結(jié)構(gòu)。無錫冷凍透射電鏡技術(shù)哪家好冷凍電鏡技術(shù)測(cè)定結(jié)構(gòu)的幾種方法:X射線晶體學(xué)、NMR、和冷凍電鏡技術(shù)。
冷凍電鏡技術(shù)解析結(jié)構(gòu)主要風(fēng)險(xiǎn)在:A.樣品很不穩(wěn)定,樣品寄送過來的時(shí)候,已經(jīng)降解或者聚集,無法進(jìn)行后續(xù)處理;B.樣品在冷凍制樣的過程中,可能會(huì)被凍碎,從而無法進(jìn)行后續(xù)處理;C.樣品純度可能很好,但是均一度很差,從而難以獲得樣品的高分辨結(jié)構(gòu);D.我們關(guān)心的區(qū)域可能在整個(gè)復(fù)合體中有很強(qiáng)的柔性,從而經(jīng)過二維或者三維平均后,我們關(guān)心區(qū)域的分辨率會(huì)比較差甚至看不見,達(dá)不到我們的預(yù)期;E.一些配體,比如藥物前體分子,分子量太小,不一定能在電鏡的密度圖中觀測(cè)到;F.對(duì)于合適的樣品,我們冷凍制樣需要優(yōu)化的參數(shù)有很多,包括樣品濃度的優(yōu)化,blottime的優(yōu)化,溫度的優(yōu)化,grid規(guī)格(銅網(wǎng)或者金網(wǎng))的優(yōu)化等一系列條件的優(yōu)化。因此冷凍電鏡制樣需要豐富的經(jīng)驗(yàn)和充足的機(jī)時(shí)支持,不同的實(shí)驗(yàn)者,成功率可能差別很大。
冷凍電鏡技術(shù)也正在成為助力醫(yī)藥研發(fā)的有力手段。依托對(duì)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的理解,科學(xué)家正在開發(fā)更有效的治Ca藥、打菌素、止痛藥、麻醉劑等。中國過去10多年里,建成了世界上較大的冷凍電鏡設(shè)施。中國的科學(xué)家,也在冷凍電鏡領(lǐng)域取得了很多舉世矚目的成就,引起了世界的普遍關(guān)注。比如清華大學(xué)的施一公團(tuán)隊(duì),對(duì)老年癡呆癥相關(guān)的重要蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)進(jìn)行了解析,對(duì)于我們理解它的發(fā)病機(jī)理甚至開發(fā)重要治療方法有重要意義。他們對(duì)剪接體復(fù)合體一系列結(jié)構(gòu)的研究幫助我們理解細(xì)胞的演化、細(xì)胞的基因調(diào)控和其他一些相關(guān)疾病有著重要意義。2019年,中國科學(xué)家利用冷凍電鏡技術(shù)解析到世界上目前分辨率較高的豬瘟病毒結(jié)構(gòu),這對(duì)我們了解該病毒的發(fā)病機(jī)理,以及如何更好開發(fā)疫苗具有重要意義。冷凍電鏡技術(shù)就是在傳統(tǒng)透射電子顯微鏡之上,加上了低溫傳輸系統(tǒng)和冷凍防污染系統(tǒng)。
冷凍電子顯微鏡技術(shù)中單顆粒重構(gòu)技術(shù):該技術(shù)也叫做單顆粒分析,主要適用于結(jié)構(gòu)具有全同性的生物大分子的結(jié)構(gòu)解析,蛋白質(zhì)的分子量通常要求在100KD以上,在顆粒數(shù)目足夠多的情況下,理論上其分辨率可以達(dá)到原子水平。該方法的圖像處理和三維重構(gòu)計(jì)算過程如下:從原始的電鏡照片中將顆粒圖像挑選出來,對(duì)其進(jìn)行二維圖像對(duì)中、分類和平均,然后通過計(jì)算等價(jià)線的方法推算各分類圖的取向,利用傅里葉重構(gòu)法建立始三維結(jié)構(gòu)模型,通過對(duì)原始圖片或分類平均圖與結(jié)構(gòu)模型投影的匹配,優(yōu)化取向參數(shù),進(jìn)而得到更準(zhǔn)確的三維結(jié)構(gòu)模型,如此反復(fù)對(duì)初始結(jié)構(gòu)模型進(jìn)行修正,直到收斂獲得較終的結(jié)果。單顆粒重構(gòu)技術(shù)近年來發(fā)展迅速,應(yīng)用普遍,不斷有文章報(bào)道利用此技術(shù)所獲得的大分子復(fù)合物的三維結(jié)構(gòu)。冷凍電鏡技術(shù)能夠提供生理環(huán)境下大分子復(fù)合物納米、亞納米甚至近原子尺度的原位結(jié)構(gòu)信息。湖州原位冷凍電鏡技術(shù)品牌
冷凍電鏡技術(shù),是一種重要的結(jié)構(gòu)生物學(xué)研究方法。黃石低溫透射電鏡技術(shù)
冷凍電鏡技術(shù)在結(jié)構(gòu)生物學(xué)中的應(yīng)用:冷凍電鏡技術(shù)主要應(yīng)用在單個(gè)蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)的分析方面。此外,冷凍電子顯微鏡技術(shù)還將普遍應(yīng)用于細(xì)胞組織的超微結(jié)構(gòu)解析,對(duì)解開生命活動(dòng)的規(guī)律和機(jī)制等奧秘會(huì)產(chǎn)生更大影響。有人創(chuàng)造了利用冷凍電鏡單顆粒分析技術(shù)解析至近原子分辨率的分子量較小的生物大分子的記錄。施一公研究組解析了γ-secretase蛋白質(zhì)和RyR-1蛋白質(zhì)。研究組解析了Mammalianrespirasome蛋白質(zhì)。隨著越來越多蛋白質(zhì)神秘面紗的揭開,我們可以更好地解釋各種各樣的生命活動(dòng)發(fā)生的原因和機(jī)理。利用冷凍電鏡技術(shù)觀察到的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu),我們可以定向改造或構(gòu)建新的蛋白質(zhì)用于科研或醫(yī)療領(lǐng)域。黃石低溫透射電鏡技術(shù)
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