冷凍電鏡技術(shù)解析結(jié)構(gòu)的一般流程是怎樣的？對樣品的要求是什么？冷凍電鏡解析蛋白結(jié)構(gòu)一般流程為：蛋白表達(dá)純化；負(fù)染樣品準(zhǔn)備：約2小時完成；負(fù)染樣品的數(shù)據(jù)收集：約8小時完成；冷凍樣品的準(zhǔn)備：約4小時完成；冷凍樣品的數(shù)據(jù)收集：48-120小時完成。三維結(jié)構(gòu)重建。冷凍電鏡解析蛋白結(jié)構(gòu)對蛋白質(zhì)的要求：分子量：一般需要樣品的分子量在200kD以上。緩沖液：緩沖液中不能含有多糖，DMSO，甘油等有機(jī)物質(zhì)，這些會降低樣品的襯度，難以獲得高分辨的三維結(jié)構(gòu)。一般而言，緩沖液為20mMHepes，150mMNaCl。濃度：一般而言，可溶性蛋白濃度應(yīng)在1mg/ml左右，膜蛋白應(yīng)保證濃度在5mg/ml左右。體積：20ul足夠（前提是需要蛋白濃度達(dá)標(biāo)，做一個樣品3ul左右）。均一性：分子篩行為表現(xiàn)為單一的峰，均一性大于90%。冷凍電子顯微技術(shù)學(xué)解析生物大分子及細(xì)胞結(jié)構(gòu)的中心是透射電子顯微鏡成像。十堰快速冷凍顯微鏡技術(shù)特點

冷凍電鏡技術(shù)中的單顆粒分析法（Singleparticleanalysis,SPA）：單顆粒技術(shù)獲得投影的具體方法：制備很多具有同樣結(jié)構(gòu)的大分子樣品，將其進(jìn)行分散冷凍后進(jìn)行隨機(jī)的投影拍照，再通過計算模擬測定角度，對具有相同角度的粒子進(jìn)行組合，突出其中更特殊、更容易解釋的特征。單顆粒冷凍電鏡是針對單個粒子進(jìn)行重構(gòu)的技術(shù)，但我們的研究對象往往是多構(gòu)象或結(jié)構(gòu)異質(zhì)的蛋白，顆粒之間存在細(xì)微差別，這是一些蛋白質(zhì)無法獲得高分辨結(jié)構(gòu)的重要原因之一。對于結(jié)構(gòu)異質(zhì)性樣品的分析，我們需要首先將樣品分成幾個同質(zhì)的子集，然后分別進(jìn)行三維重建。由于單顆粒分析法理論成像分辨率更高，尤其在分析具有同質(zhì)性結(jié)構(gòu)的樣品時表現(xiàn)出更方便、更優(yōu)異的成像能力，因此得到了更普遍的應(yīng)用。單顆粒分析法的研究對象可以是具有某種對稱性的顆粒，也可是不具有任何對稱性的蛋白分子或復(fù)合體，尤其是針對核糖體的表征。南通Cryo-TEM技術(shù)哪里有冷凍電鏡技術(shù)具有更接近天然狀態(tài)、適用研究對象普遍等優(yōu)勢。

單顆粒冷凍電鏡技術(shù)：生物大分子快速冷凍后，在低溫下利用透射電子顯微鏡對結(jié)構(gòu)均一、分散的全同樣品顆粒進(jìn)行成像，再經(jīng)圖像處理及重構(gòu)計算獲得樣品的三維結(jié)構(gòu)?？裳芯可锎蠓肿釉谌芤褐械慕Y(jié)構(gòu)及構(gòu)象變化、無需結(jié)晶、所需樣品量相對較少，適合于蛋白質(zhì)、病毒等生物大分子及其復(fù)合物的結(jié)構(gòu)生物學(xué)研究。樣品制備：可以根據(jù)樣品、電鏡載網(wǎng)和其他使用條件，摸索合適的單顆粒樣品制備條件，純化、收集濃度范圍從幾微升50nM至5uM濃度的蛋白溶液來制備單顆粒電鏡樣品。在-196℃時，組織中的生物大分子能夠長期保持穩(wěn)定性、細(xì)胞活性及組織微觀結(jié)構(gòu)，同時，在低溫下，生物樣品耐受電子輻照劑量增強(qiáng)，且其在電鏡鏡筒的高真空環(huán)境中脫水變形的問題也得以解決。Vitrobot和EMGP2均能夠提供快速、簡單、可重復(fù)的安自動化樣品玻璃化制備過程，其在恒定的物理和機(jī)械條件下（如溫度、相對濕度、吸濕條件和冷凍速度）對樣品進(jìn)行冷凍固定確保生物樣品在低溫狀態(tài)下仍保持天然構(gòu)象。

冷凍電鏡技術(shù)揭示生物分子細(xì)節(jié)：科學(xué)家在透射電子顯微鏡之上發(fā)明了冷凍電鏡，實現(xiàn)了生物分子“近原子級”的分辨率，讓人類終于可以一窺究竟生物分子是如何執(zhí)行其功能。在過去幾年里，冷凍電子顯微鏡技術(shù)逐漸成為結(jié)構(gòu)生物學(xué)的重要研究工具。冷凍電鏡技術(shù)的基本原理是將生物大分子溶液置于電鏡載網(wǎng)上形成一層非常薄的水膜，然后利用快速冷凍技術(shù)將其瞬間冷凍至液氮溫度下。冷凍速度非?？?，以至于水膜無法形成晶體，而是形成一層玻璃態(tài)的冰。生物大分子就被固定在這層薄冰里。將這樣的冷凍樣品保持低溫放置在透射電子顯微鏡下觀察，從而獲得生物大分子的結(jié)構(gòu)，被稱為冷凍電鏡技術(shù)。冷凍電鏡技術(shù)的獨特優(yōu)勢：冷凍電鏡單粒子法既可以對具有對稱結(jié)構(gòu)的大分子進(jìn)行研究。

冷凍電鏡技術(shù)測定結(jié)構(gòu)的幾種方法：X射線晶體學(xué)、NMR、和冷凍電鏡技術(shù)各有優(yōu)缺點，將這幾種方法結(jié)合共同研究結(jié)構(gòu)與功能將使結(jié)構(gòu)生物學(xué)家對所研究的分子有更為全部的理解，而這些信息是單用任何一個方法所無法獲得的。將X射線晶體模型與經(jīng)電鏡獲得的密度圖重合可以對電鏡三維重構(gòu)的結(jié)構(gòu)作更詳盡的解釋，例如將牛的水通道（AQP1,與人的有90%同源性）的高分辨率的晶體結(jié)構(gòu)與先前用冷凍電鏡技術(shù)重構(gòu)出來的人的中等分辨率水通道的三維結(jié)構(gòu)進(jìn)行比較，可以進(jìn)一步確定冷凍電鏡獲得的中等分辨率的結(jié)構(gòu)，同時也顯示出了冷凍電鏡技術(shù)的優(yōu)勢和局限性。另一方面，較低分辨率的電鏡三維重構(gòu)模型可以用來解釋病毒或大分子的晶體結(jié)構(gòu)。而且，將X射線晶體的精細(xì)結(jié)構(gòu)與冷凍電鏡的重構(gòu)模型結(jié)合構(gòu)建生物大分子復(fù)合物在發(fā)揮功生物學(xué)功能過程中出現(xiàn)的構(gòu)像變化模型。這很大程度增加了我們對于復(fù)雜分子的活動機(jī)制的理解。電子顯微技術(shù)，成像技術(shù)，計算機(jī)技術(shù)，生物信息技術(shù)等不同學(xué)科的結(jié)合，將為我們提供研究生命現(xiàn)象與本質(zhì)的強(qiáng)有力的手段。冷凍電鏡技術(shù)之冷凍蝕刻電子顯微鏡優(yōu)點：冷凍蝕刻的樣品，經(jīng)鉑、碳噴鍍而制備的復(fù)型膜具有很強(qiáng)的立體感。連云港低溫電子顯微鏡技術(shù)應(yīng)用

冷凍電鏡技術(shù)測定結(jié)構(gòu)的幾種方法：X射線晶體學(xué)、NMR、和冷凍電鏡技術(shù)。十堰快速冷凍顯微鏡技術(shù)特點

冷凍電鏡技術(shù)基本原理之電鏡三維重構(gòu)理論：D.DeRosier和A.Klug提出三維重構(gòu)理論是借助一系列沿不同方向投影的電子顯微像來重構(gòu)被測物體的立體構(gòu)型，利用計算機(jī)數(shù)字圖像處理技術(shù)進(jìn)行電子顯微像三維重構(gòu)測定生物大分子結(jié)構(gòu)的概念和方法。透射電子顯微鏡成像過程中，電子束穿透樣品，將樣品的三維電勢密度分布函數(shù)沿著電子束的傳播方向投影至與傳播方向垂直的二維平面上。運(yùn)用中心截面定理，從而可以通過三維物體不同角度的二維投影在計算機(jī)內(nèi)進(jìn)行三維重構(gòu)來解析獲得物體的三維結(jié)構(gòu)。十堰快速冷凍顯微鏡技術(shù)特點

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