聚合酶鏈反應的常見問題分析與解決方法：反應緩沖液未完全融化或未充分混勻。確保反應緩沖液融化完全并徹底混勻。引物特異性差。利用BLAST檢查引物特異性或重新設計引物。引物量過多。減少反應體系中引物的用量。模板量過多。質粒DNA的用量應<50ng，而基因組DNA則應<200ng。外源DNA污染。確保操作的潔凈。陰性對照出現(xiàn)條帶：試劑，頭，工作臺污染。使用全新的試劑和頭，對工作臺進行清潔。條帶大小與理論不符：污染。使用全新的試劑和頭，對工作臺進行清潔。模板或引物使用錯誤。更換引物和模板?；騺喰?。對研究的基因進行序列分析和BLAST研究。聚合酶鏈式反應可看作是生物體外的特殊DNA復制。徐州特殊樣本熒光PCR哪家好

聚合酶鏈式反應是80年代中期發(fā)展起來的體外核酸擴增技術。工具/原料：擴增緩沖液，四種dNTP，引物，模板DNA，Taq DNA聚合酶， Mg離子，蒸餾水。模板DNA的變性：模板DNA經加熱至93℃左右一定時間后，使模板DNA雙鏈或經PCR擴增形成的雙鏈DNA解離，使之成為單鏈，以便它與引物結合，為下輪反應作準備；模板DNA與引物的退火(復性)：模板DNA經加熱變性成單鏈后，溫度降至55℃左右，引物與模板DNA單鏈的互補序列配對結合；引物的延伸：DNA模板--引物結合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP為反應原料，靶序列為模板，按堿基配對與半保留復制原理，合成一條新的與模板DNA 鏈互補的半保留復制鏈。重復循環(huán)變性--退火--延伸三過程，就可獲得更多的“半保留復制鏈”，而且這種新鏈又可成為下次循環(huán)的模板。徐州分子生物學熒光PCR哪家好聚合酶鏈反應可用于產生突變基因，突變由科學家隨意選擇。

聚合酶鏈式反應又稱多聚酶鏈式反應，是一項利用DNA雙鏈復制的原理，在生物體外復制特定DN段的核酸合成技術。透過這項技術，可在短時間內大量擴增目的基因，而不必依賴大腸桿菌或酵母菌等生物體。聚合酶鏈反應是是一種簡單，廉價和可靠的方法復制DN段，這個概念適用于現(xiàn)物學和相關科學的許多領域。 PCR可能是分子生物學中使用很較廣的技術。這種技術被用于生物醫(yī)學研究，犯罪取證和分子考古學。通常，PCR由一系列20-40次重復的溫度變化組成，稱為熱循環(huán)，每個循環(huán)通常由兩個或三個離散的溫度步驟組成。

聚合酶鏈反應：嵌套聚合酶鏈反應:通過減少DNA非特異性擴增的背景，提高DNA擴增的特異性。兩組引物用于兩個連續(xù)的PCR。在個反應中，一對引物用于產生DNA產物，除了預期的靶之外，該產物可能仍然由非特異性擴增的DN段組成。然后用一組引物將產物用于第二次聚合酶鏈反應，所述引物的結合位點完全或部分不同于次反應中使用的每個引物，并且位于其中的3’。嵌套式PCR在特異性擴增長DN段方面通常比傳統(tǒng)PCR更成功，但它需要更詳細的目標序列知識。重疊延伸聚合酶鏈反應或者通過重疊延伸拼接(SOEing):一種用于將兩個或多個含有互補序列的DN段拼接在一起的基因工程技術。它用于連接含有基因、調節(jié)序列或突變的DN段；這項技術可以創(chuàng)造特定的長DNA構建體。它還可以將缺失、插入或點突變引入DNA序列?，F(xiàn)在有些PCR因為擴增區(qū)很短，即使Taq酶活性不是很好也能在很短的時間內復制完成。

聚合酶鏈式反應準備：引物內部不應出現(xiàn)互補序列。兩個引物之間不應存在互補序列，尤其是避免3 ′端的互補重疊。引物與非特異擴增區(qū)的序列的同源性不要超過70%，引物3′末端連續(xù)8個堿基在待擴增區(qū)以外不能有完全互補序列，否則易導致非特異性擴增。引物3‘端的堿基，特別是很末及倒數(shù)第二個堿基，應嚴格要求配對，很好選擇是G和C。引物的5′端可以修飾。如附加限制酶位點，引入突變位點，用生物素、熒光物質、地高辛標記，加入其它短序列，包括起始密碼子、終止密碼子等。聚合酶鏈式反應是80年代中期發(fā)展起來的體外核酸擴增技術。蘇州細胞Real-time PCR原理

聚合酶鏈反應應經常使用帶有一次性柱塞和超長移液器吸頭的移液器。徐州特殊樣本熒光PCR哪家好

聚合酶鏈式反應：反應的控制：PCR反應的緩沖液 提供合適的酸堿度與某些離子；鎂離子濃度 總量應比dNTPs的濃度高，常用1.5mmol/L；底物濃度 dNTP以等摩爾濃度配制，20～200umol/L；TaqDNA聚合酶 2.5U(100ul）；引物濃度一般為0.1 ～ 0.5umol/L；反應溫度和循環(huán)次數(shù)；變性溫度和時間 95℃，30s；退火溫度和時間 低于引物Tm值5 ℃左右，一般在45～55℃；延伸溫度和時間 72℃，1min/kb(10kb內）；Tm值=4(G+C) +2(A+T)；循環(huán)次數(shù) ：一般為25 ～ 30次。循環(huán)數(shù)決定PCR擴增的產量。模板初始濃度低，可增加循環(huán)數(shù)以便達到有效的 擴增量。但循環(huán)數(shù)并不是可以無限增加的。一般循環(huán)數(shù)為30個左右，循環(huán)數(shù)超過30個以后，DNA聚合酶活性逐漸達到飽和，產物的量不再隨循環(huán)數(shù)的增加而增加，出現(xiàn)了所謂的“平臺期”。徐州特殊樣本熒光PCR哪家好