1990年初，當WinfriedDenk剛從康奈爾大學博士畢業(yè)準備前往瑞士讀博后時，他看了一本關于激光掃描顯微鏡的書，從中了解到非線性光學效應——強光和物質的相互作用。當時，Denk有同事研究生物樣品中的鈣離子但苦于沒有強大的紫外激光器和光學元件，于是他就想到如果使用雙光子吸收就能夠繞開紫外，換言之，與其通過一個紫外光子激發(fā)標記的鈣離子，通過兩個雙倍波長的可見光光子也能激發(fā)相同的熒光。有了想法后馬上實驗。借了一套染料飛秒激光器，Denk聯合他的導師WattWebb及其博士生JamesStrickler只用六個小時就完成了實驗搭建，采集數據則用了兩到三天，于是一篇里程碑式的文章就此誕生了。用雙光子顯微鏡看看你的皮膚有沒有重煥新生。國外bruker雙光子顯微鏡熒光探測

雙光子顯微成像的在生物醫(yī)學研究和醫(yī)療領域應用有較大的應用前景，首先雙光子顯微鏡能夠進行細胞和組織結構成像，在亞微米級成像，此功能與目前市場上的共聚焦類顯微鏡性能類似；雙光子顯微成像能夠實時、在體、原位、無創(chuàng)地，根據不同物質組份的光譜特性，區(qū)分成像；雙光子顯微鏡能夠進行生化指標成像，在無造影劑的前提下，利用自發(fā)熒光、二次諧波、熒光獲得活細胞生化信息。雙光子顯微鏡技術在醫(yī)療診斷應用中具有巨大的潛力，該領域還未形成標準和體系，需要系統的醫(yī)學研究與龐大的醫(yī)療數據加以支撐，通過研究人體基于多光子成像技術，進行細胞結構、生化成分、微環(huán)境、組織形態(tài)、代謝功能的影響信息，找到與疾病的細胞學、分子生物學、組織病理學、診斷和***特征的關聯關系，共同探究生理病理基礎和分子細胞生物學機制，篩選鑒定**、皮膚病、自身免疫病及其他疑難疾病的診斷及鑒別診斷依據，建立全新的多光子細胞診斷的完整數據庫，定義出針對不同疾病的多光子臨床檢測設備的產品標準。國外雙光子顯微鏡聯系方式雙光子顯微鏡角膜成像。

雙光子顯微鏡是結合了激光掃描共聚焦顯微鏡和雙光子激發(fā)技術的一種新技術。雙光子激發(fā)的基本原理是：在高光子密度的情況下，熒光分子可以同時吸收2個長波長的光子，在經過一個很短的所謂激發(fā)態(tài)壽命的時間后，發(fā)射出一個波長較短的光子；其效果和使用一個波長為長波長一半的光子去激發(fā)熒光分子是相同的。雙（多）光子成像優(yōu)勢在于，具有更深的組織穿透深度，利用紅外光，能夠在層面檢測極限達1mm的組織區(qū)域；因信號背景比高，而具有更高的對比度；因激發(fā)體積小，具有定點激發(fā)的特性，具有更少的光毒性；激發(fā)波長由紫外、可見光調整為紅外激發(fā)，能夠更加安全。

從雙光子到三光子：科學家正在從雙光子轉向三光子顯微鏡。1996年，ChrisXu在康奈爾大學(Denk同導師實驗室)讀博期間發(fā)明了三光子顯微鏡，如果雙光子吸收可行，那么三光子看起來也是自然的發(fā)展方向。三光子成像使用更長的波長，大約在1.3和1.7微米，其成像深度也比雙光子更深，目前記錄約為2.2毫米，人類大腦皮層厚約4毫米。相比雙光子顯微鏡，三光子還要求以較低重頻使用更強和更短的激光脈沖，而傳統的鈦寶石激光器難以達到這些要求，但是對于摻鐿光纖飛秒光參量放大器則非常容易，比如我們的Y-Fi光參量放大器(OPA)。于雙光子激發(fā)需要兩個光子同時到達，因此只有在焦點附近的樣品區(qū)域才會激發(fā)，從而實現三維成像和高分辨率。

雙光子顯微鏡的優(yōu)勢：在深度組織中以較長時間對活細胞成像，雙光子顯微鏡是當前之選。雙光子和共聚焦顯微鏡都是通過激光激發(fā)樣品中的熒光標記，使用探測器測量被激發(fā)的熒光。但是，共聚焦一般使用單模光纖耦合激光器，通過單光子激發(fā)熒光，而雙光子使用飛秒激光器，通過幾乎同時吸收兩個長波光子激發(fā)熒光。下面是兩種技術的對比圖。雙光子激發(fā)熒光的主要優(yōu)勢：雙光子比共聚焦使用的更長的波長，所以對組織的損傷更小且穿透更深。共聚焦的成像深度一般為100微米，雙光子則能達到250到500微米，甚至超過1毫米。另外，同時吸收兩個光子意味只有較強度聚焦點處能被激發(fā)，所以不會損傷焦平面之外的組織，并且生成更清晰的圖像。顯微成像技術包含：雙光子顯微鏡、寬場熒光顯微鏡、共聚焦顯微鏡、全內反射熒光顯微鏡等多種成像方式。美國bruker雙光子顯微鏡最大分辨率

雙光子顯微鏡可以進行厚的組織樣品拍攝。國外bruker雙光子顯微鏡熒光探測

光學顯微鏡從1590年發(fā)明以來，不斷發(fā)展，促進生命科學日新月異的發(fā)現，幫助人類逐層打開生命本質的大門。同時，生命科學的發(fā)展不斷給光學顯微鏡提出新的要求，促使成像理論和技術持續(xù)更新迭代?？茖W進入21世紀，人們已經不滿足于在體外研究細胞和組織，需要能夠更真實地探索生命，在體內實時觀察細胞的發(fā)生和變化。此時，雙光子顯微鏡進入了科學家的視野。在高光子密度的情況下，熒光分子可以同時吸收兩個長波長的光子，然后發(fā)射出一個波長較短的光子，其效果和使用一個波長為長波長一半的光子去激發(fā)熒光分子是相同的（圖1）。如煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH），在單光子激發(fā)時，在波長為350nm光的激發(fā)下發(fā)出450nm熒光；而在雙光子激發(fā)時，可采用700nm的激發(fā)光得到450nm熒光。國外bruker雙光子顯微鏡熒光探測