雙光子顯微鏡是結(jié)合了激光掃描共聚焦顯微鏡和雙光子激發(fā)技術(shù)的一種新技術(shù)。雙光子激發(fā)的基本原理是：在高光子密度的情況下，熒光分子可以同時吸收2個長波長的光子，在經(jīng)過一個很短的所謂激發(fā)態(tài)壽命的時間后，發(fā)射出一個波長較短的光子；其效果和使用一個波長為長波長一半的光子去激發(fā)熒光分子是相同的。雙（多）光子成像優(yōu)勢在于，具有更深的組織穿透深度，利用紅外光，能夠在層面檢測極限達1mm的組織區(qū)域；因信號背景比高，而具有更高的對比度；因激發(fā)體積小，具有定點激發(fā)的特性，具有更少的光毒性；激發(fā)波長由紫外、可見光調(diào)整為紅外激發(fā)，能夠更加安全。雙光子顯微鏡的原理是什么？激光熒光雙光子顯微鏡原理

在高光子密度的情況下，熒光分子可以同時吸收兩個長波長的光子，然后發(fā)射出一個波長較短的光子，其效果和使用一個波長為長波長一半的光子去激發(fā)熒光分子是相同的如煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH），在單光子激發(fā)時，在波長為350nm光的激發(fā)下發(fā)出450nm熒光；而在雙光子激發(fā)時，可采用700nm的激發(fā)光得到450nm熒光。由于雙光子激發(fā)需要很高的光子密度，為了不損傷細胞，雙光子顯微鏡使用高能量鎖模脈沖激光器。這種激光器發(fā)出的激光具有很高的峰值能量和很低的平均能量，從而可以減少光漂白和光毒性帶來的不利影響。激光熒光雙光子顯微鏡原理雙光子顯微鏡能夠進行光裂解、光轉(zhuǎn)染和光損傷等光學操縱。

1990年初，當WinfriedDenk剛從康奈爾大學博士畢業(yè)準備前往瑞士讀博后時，他看了一本關(guān)于激光掃描顯微鏡的書，從中了解到非線性光學效應——強光和物質(zhì)的相互作用。當時，Denk有同事研究生物樣品中的鈣離子但苦于沒有強大的紫外激光器和光學元件，于是他就想到如果使用雙光子吸收就能夠繞開紫外，換言之，與其通過一個紫外光子激發(fā)標記的鈣離子，通過兩個雙倍波長的可見光光子也能激發(fā)相同的熒光。有了想法后馬上實驗。借了一套染料飛秒激光器，Denk聯(lián)合他的導師WattWebb及其博士生JamesStrickler只用六個小時就完成了實驗搭建，采集數(shù)據(jù)則用了兩到三天，于是一篇里程碑式的文章就此誕生了。

在深度組織中以較長時間對活細胞成像，雙光子顯微鏡是當前之選。雙光子和共聚焦顯微鏡都是通過激光激發(fā)樣品中的熒光標記，使用探測器測量被激發(fā)的熒光。但是，共聚焦一般使用單模光纖耦合激光器，通過單光子激發(fā)熒光，而雙光子使用飛秒激光器，通過幾乎同時吸收兩個長波光子激發(fā)熒光。雙光子激發(fā)熒光的主要優(yōu)勢：雙光子比共聚焦使用的更長的波長，所以對組織的損傷更小且穿透更深。共聚焦的成像深度一般為100微米，雙光子則能達到250到500微米，甚至超過1毫米。另外，同時吸收兩個光子意味只有度聚焦點處能被激發(fā)，所以不會損傷焦平面之外的組織，并且生成更清晰的圖像。對于顯微成像技術(shù)包含：寬場熒光顯微鏡、激光共聚焦顯微鏡、轉(zhuǎn)盤共聚焦顯微鏡、雙光子顯微鏡。

系統(tǒng)示意圖如圖1所示，紅外激光束從藍寶石激光器出射后，由一個光學參量振蕩器（OPO）轉(zhuǎn)化到可見光波段，產(chǎn)生的可見光脈沖寬度為200fs,重復頻率80MHz，波長在490-750nm范圍內(nèi)可調(diào)諧。光束通過透鏡及平面鏡中繼到包含微透鏡陣列盤和陣列盤的共聚焦掃描單元中，形成用于熒光激發(fā)的多焦點光束。多焦點光束通過一個硅油浸潤的物鏡成像到樣品上，激發(fā)熒光信號。熒光信號由同一個物鏡收集并傳輸?shù)疥嚵袌A盤，產(chǎn)生共焦效應，隔離來自焦平面外的雜散光。雙光子顯微鏡在多個領(lǐng)域研究中已有許多成功實例。激光熒光雙光子顯微鏡原理

這種雙光子顯微鏡的視場是普通顯微鏡的10倍。激光熒光雙光子顯微鏡原理

后續(xù)實驗使用碘化丙啶(PI)來指示細胞在7、8、9和10分鐘的延時觀察后的損傷情況，來驗證該光學系統(tǒng)對活細胞長期觀察的適用性。在觀察期間，88個焦點以100毫秒的曝光時間，曝光間隔1s照射樣品，激發(fā)強度為3.21×104W/cm2，激發(fā)波長為525nm，使用前文提到的60×物鏡及1.0AU孔徑，圖5(a)-(d)為引入PI的成像圖，(e)-(h)為相應的相應襯度圖。改變激發(fā)條件為每照射500ms間隔5s，得到相應的(i)-(p)。由圖像可知，延時觀察小于8分鐘的情況下不造成可見細胞損傷，對于實際3D延時成像，由于焦平面是移動的，所以預期細胞存活時間會更長，可見這是一種在3D在體延時成像中具有很大優(yōu)勢的成像方案。激光熒光雙光子顯微鏡原理