雙光子顯微鏡(2PM)可以對(duì)鈣離子傳感器和谷氨酸傳感器進(jìn)行亞細(xì)胞分辨率的成像，從而測量不透明腦深部的活動(dòng)。成像膜的電壓變化可以直接反映神經(jīng)元的活動(dòng)，但神經(jīng)元活動(dòng)的速度對(duì)于常規(guī)的2PM來說太快了。目前，電壓成像主要由寬視場顯微鏡實(shí)現(xiàn)，但其空間分辨率較差，且只能在淺深度成像。因此，為了以高空間分辨率成像不透明腦中膜電壓的變化，需要將成像速率提高2PM。面向模塊輸出端的子脈沖序列可視為從虛擬光源陣列發(fā)出的光，這些子脈沖在中繼到顯微鏡物鏡后形成空間分離和時(shí)間延遲的聚焦陣列。然后，該模塊被集成到一個(gè)帶有高速數(shù)據(jù)采集系統(tǒng)的標(biāo)準(zhǔn)雙光子熒光顯微鏡中，如圖2所示。光源是重復(fù)頻率為1MHz的920nm激光器。FACED模塊可以產(chǎn)生80個(gè)脈沖焦點(diǎn)，脈沖時(shí)間間隔為2ns。這些焦點(diǎn)是虛擬源的圖像。虛光源越遠(yuǎn)，物鏡處的光束尺寸越大，焦點(diǎn)越小。光束可以沿Y軸比沿X軸更好地填充物鏡，從而在X軸上產(chǎn)生0.82m和0.35m的橫向分辨率。雙光子顯微鏡放大倍數(shù)是多少？國內(nèi)ultimainvestigator雙光子顯微鏡光損傷

n摻雜可以明顯影響碳點(diǎn)(CDs)的發(fā)射和激發(fā)特性，使雙光子碳點(diǎn)(TP-CDs)具有本征雙光子激發(fā)特性和605nm紅光發(fā)射特性。在638nm激光的照射下，除了長波激發(fā)和發(fā)射外，還能產(chǎn)生活性氧，這為光動(dòng)力技術(shù)提供了極大的可能性。更重要的是，各種表征和理論模擬證實(shí)了摻雜誘導(dǎo)的N雜環(huán)在TP-CDs與RNA的親和力中起著關(guān)鍵作用。這種親和力不僅可以實(shí)現(xiàn)核仁特異性的自我靶向，還可以通過ROS斷裂RNA鏈來解離TP-CDs@RNA復(fù)合物，從而在治療過程中產(chǎn)生熒光變化。TP-CDs結(jié)合了ROS產(chǎn)生的能力、PDT過程中的熒光變化、長波激發(fā)和發(fā)射特性以及核仁特異性自靶向性，因此可以認(rèn)為是一種實(shí)時(shí)處理核仁動(dòng)態(tài)變化的智能CDs。國內(nèi)investigator雙光子顯微鏡光毒性雙光子顯微鏡在組織透明化成像中應(yīng)用；

通過并行化不同激光波長的激光掃描，研究人員增加了在相同時(shí)間內(nèi)可以成像的體積，同時(shí)保持了高的時(shí)間和空間分辨率。研究人員通過引入兩種不同波長的鈣信號(hào)熒光探針，將神經(jīng)元群體的活動(dòng)標(biāo)記為兩種不同的顏色，同時(shí)激發(fā)兩種不同波長的探針，從而實(shí)現(xiàn)了兩種顏色的并行數(shù)據(jù)記錄。為了實(shí)現(xiàn)三維空間成像，研究人員還在兩個(gè)激光束上配置了快速變焦系統(tǒng)，即一個(gè)電透鏡和一個(gè)空間光調(diào)制器。因此，可以以10Hz的速度同時(shí)記錄10個(gè)500微米和500微米的平面，覆蓋600微米的深度，覆蓋大腦皮層第二層到第五層的結(jié)構(gòu)，體積內(nèi)可以記錄2000多個(gè)神經(jīng)元。

實(shí)驗(yàn)從理論和實(shí)驗(yàn)上評(píng)估了多焦點(diǎn)v2PE顯微鏡的空間分辨率，并與單光子熒光顯微鏡進(jìn)行了對(duì)比，實(shí)驗(yàn)中v2PE的激發(fā)波長為521nm，使用放大倍率為100倍的物鏡，尺寸為0.6AU，對(duì)直徑100nm的熒光顆粒進(jìn)行了測試性成像，共獲得40幅不同采樣深度的圖像合成為三維圖像。圖像在橫向和縱向的半高全寬分別是177nm和297nm，這些值接近顯微鏡的理論分辨率。后續(xù)還利用軟件模擬從理論上研究了多焦點(diǎn)v2PE顯微技術(shù)的空間分辨率，模擬計(jì)算顯示v2PE點(diǎn)擴(kuò)散函數(shù)(PSF)的橫向半高寬與單光子激發(fā)熒光(1PE)相似，軸向的半高寬較1PE減少，可以提高空間分辨率。成像平臺(tái)倒置雙光子顯微鏡啟用顯微鏡自帶調(diào)焦設(shè)備。

在傳統(tǒng)寬場顯微鏡中，來自標(biāo)本不同縱深的光線都可投射到同一焦平面（感光元件）上，所以其成像是整個(gè)樣品的重疊像，沒有縱向分辨能力。單光子激光共聚焦顯微鏡用針空有效濾除了雜散光，分辨率有了本質(zhì)上的提高，擁有了對(duì)樣品的特定焦平面精細(xì)成像的能力，可以進(jìn)行三維成像、動(dòng)態(tài)成像等。然而，針空在濾除雜散光的同時(shí)也將大部分來自焦平面的熒光濾除了，只有很弱的熒光到達(dá)檢測器。若要提高信號(hào)強(qiáng)度，需要加大激發(fā)光功率，這又會(huì)導(dǎo)致對(duì)活細(xì)胞的光毒性和熒光分子的光漂白增加。雙光子顯微鏡蕞大的優(yōu)勢來源于其雙光子光源的非線性光學(xué)效應(yīng)，與單光子共聚焦顯微鏡蕞大的不同在于無須使用針空限制光學(xué)散射，其具體優(yōu)勢如下所述。雙光子顯微鏡有哪些分類呢？國內(nèi)ultimainvestigator雙光子顯微鏡光損傷

顯微成像技術(shù)包含：雙光子顯微鏡、寬場熒光顯微鏡、共聚焦顯微鏡、全內(nèi)反射熒光顯微鏡等多種成像方式。國內(nèi)ultimainvestigator雙光子顯微鏡光損傷

從雙光子的原理和特點(diǎn)我們就可以明顯的得出雙光子的優(yōu)點(diǎn)：☆光損傷小：由于雙光子顯微鏡使用的是可見光或近紅外光作為激發(fā)光源，這一波段的光對(duì)細(xì)胞和組織的光損傷小，適用于長時(shí)間的研究；☆穿透能力強(qiáng)：相對(duì)于紫外光，可見光和近紅外光都具有更強(qiáng)的穿透能力，因而受生物組織散射的影響更小，解決對(duì)生物組織中深層物質(zhì)的層析成像研究問題；☆高分辨率：由于雙光子吸收截面很小，只有在焦平面很小的區(qū)域內(nèi)可以激發(fā)出熒光，雙光子吸收局限于焦點(diǎn)處的體積約為波長3次方的范圍內(nèi)；☆漂白區(qū)域?。河捎诩ぐl(fā)只存在于交點(diǎn)處，所以焦點(diǎn)以外的區(qū)域都不會(huì)發(fā)生光漂白現(xiàn)象；☆熒光收集率高：與共聚焦成像相比，雙光子成像不需要光學(xué)濾波器（共焦），這樣就提高了對(duì)熒光的收集率，而收集率的提高直接導(dǎo)致圖像對(duì)比度的提高；☆圖像對(duì)比度高：由于熒光波長小于入射波長，因而瑞利散射產(chǎn)生的背景噪聲只有單光子激發(fā)時(shí)的1/16，降低了散射的干擾；☆光子躍遷具有很強(qiáng)的選擇激發(fā)性，所以可以對(duì)生物組織中一些特殊物質(zhì)進(jìn)行成像的研究；國內(nèi)ultimainvestigator雙光子顯微鏡光損傷