而配合了雙光子激發(fā)技術(shù)，激光共聚掃描顯微鏡則能更好得發(fā)揮功效。那么，什么是雙光子激發(fā)技術(shù)呢？在高光子密度的情況下，熒光分子可以同時吸收2個長波長的光子使電子躍遷到較高能級，經(jīng)過一個很短的時間后，電子再躍遷回低能級同時放出一個波長為長波長一半的光子（P=h/λ）。利用這個原理，便誕生了雙光子激發(fā)技術(shù)。雙光子顯微鏡使用長波長脈沖激光，通過物鏡匯聚，由于雙光子激發(fā)需要很高的光子密度，而物鏡焦點處的光子密度是比較高的，所以只有在焦點處才能發(fā)生雙光子激發(fā)，產(chǎn)生熒光，該點產(chǎn)生的熒光再穿過物鏡，被光探頭接收，從而達到逐點掃描的效果。雙光子顯微鏡明日之星--FemtoFiber ultra 920 。進口熒光雙光子顯微鏡光子躍遷

雙光子熒光顯微鏡是結(jié)合了激光掃描共聚焦顯微鏡和雙光子激發(fā)技術(shù)的一種新技術(shù)。雙光子激發(fā)的基本原理是:在高光子密度的情況下，熒光分子可以同時吸收2個長波長的光子，在經(jīng)過一個很短激發(fā)態(tài)后，發(fā)射出一個波長較短的光子;其效果和使用一個波長為長波長一半的光子去激發(fā)熒光分子是相同的。因其光損傷小、使得觀察熒光細(xì)胞成為可能。中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)實驗動物研究所-雙光子顯微鏡成像平臺借助于雙光子顯微鏡成像技術(shù)及不同轉(zhuǎn)基因小鼠開展對多種臟器的成像研究。以小鼠顱內(nèi)成像為優(yōu)勢，可觀察小鼠顱內(nèi)神經(jīng)細(xì)胞、小膠質(zhì)細(xì)胞/巨噬細(xì)胞、周細(xì)胞、血管、轉(zhuǎn)移瘤細(xì)胞、膠質(zhì)瘤細(xì)胞等的變化情況，在**學(xué)、神經(jīng)生物學(xué)、發(fā)育生物學(xué)、神經(jīng)退行性疾病等領(lǐng)域具有廣泛應(yīng)用。小鼠其它組織臟器，如脾、顱骨、股骨、胸骨等也可借助本平臺進行成像研究。進口布魯克雙光子顯微鏡應(yīng)用雙光子顯微鏡大量運營在實驗室當(dāng)中；

利用鈣成像技術(shù)記錄大腦活動，隨著功能光學(xué)成像技術(shù)的發(fā)展，神經(jīng)學(xué)家們已經(jīng)可以研究腦區(qū)和神經(jīng)元內(nèi)部的工作情況。功能鈣成像技術(shù)就是其中之一，其主要原理是將外源性熒光信號和生理現(xiàn)象耦合起來——通過熒光染料信號的改變反映細(xì)胞內(nèi)游離鈣離子濃度，以此細(xì)胞的功能狀態(tài)。目前它被廣泛應(yīng)用于實時監(jiān)測一群相關(guān)神經(jīng)元內(nèi)鈣離子的變化，從而判斷其功能活動。該技術(shù)的出現(xiàn)使得科學(xué)家可以親眼目睹神經(jīng)信號在神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)之中時間和空間上的傳遞穿梭。

與普通顯微鏡相比，電子顯微鏡可以在更小的尺度上觀察事物，冷凍電子顯微鏡可以觀察活性生物大分子。雙光子顯微鏡有什么優(yōu)勢？它能做普通光學(xué)顯微鏡做不到的事情嗎？原來雙光子顯微鏡可以準(zhǔn)確穿透厚標(biāo)本進行定點和***觀察！因為電磁波的波長越短，粒子越強，散射的影響越大。雙光子顯微鏡將激發(fā)光源改為長波長激光，增加了激光的穿透力，同時降低了對細(xì)胞的毒性。此外，由于雙光子激發(fā)效應(yīng)只能發(fā)生在物鏡的焦點處，因此掃描精度極高，還可以提高激發(fā)光效率，減少掃描點以外的熒光物質(zhì)的消耗。雙光子顯微鏡中，同樣每個時刻只有焦平面上一個點的信號被探測，并且連焦平面外的熒光信號也不會有。

雙光子顯微鏡的基本原理是：在高光子密度的情況下，熒光分子可以同時吸收2個長波長的光子，在經(jīng)過一個很短的所謂激發(fā)態(tài)壽命的時間后，發(fā)射出一個波長較短的光子；其效果和使用一個波長為長波長一半的光子去激發(fā)熒光分子是相同的。雙光子激發(fā)需要很高的光子密度，為了不損傷細(xì)胞，雙光子顯微鏡使用高能量鎖模脈沖激光器。這種激光器發(fā)出的激光具有很高的峰值能量和很低的平均能量，其脈沖寬度只有100飛秒，而其周期可以達到80至100兆赫茲。在使用高數(shù)值孔徑的物鏡將脈沖激光的光子聚焦時，物鏡的焦點處的光子密度是比較高的，雙光子激發(fā)只發(fā)生在物鏡的焦點上，所以雙光子顯微鏡不需要共聚焦***，提高了熒光檢測效率。雙光子顯微鏡的性能得到不斷地優(yōu)化，結(jié)合它的特點，大致可以分成深和活兩個方面的提升。進口布魯克雙光子顯微鏡應(yīng)用

雙光子顯微鏡可以用于局部微蝕鐳射磨皮后的膠原重塑的檢測。進口熒光雙光子顯微鏡光子躍遷

Itrytoexplainwhytwo-photonmicroscopyhasadeeperimagingdepththanone-photonmicroscopy,intheareaofbiomedicalimaging.Manyofthebiomedicalimagingmodalities,nomatterone-photon(confocal)ormulti-photon(two-photon),uselasersaslightsourceandrequirecompatiblefluorescentdyes.Fluorescentdyeshavetheirownexcitationwavelength,andtheycaneitherbeexcitedbyasinglephotonwiththephotonenergyofthatexcitationwavelength(E=hv=h*c/λ);orbytwophotons,arrivingalmostatthesametime,buteachwithapproximatelyhalfoftheenergy,henceofdoublewavelengththanone-photon(0.5E->2λ).Theformeristheprincipleofone-photonmicroscopyandthelatteristheprincipleoftwo-photonmicroscopy.Whenimagingthesamefluorescentdye,sincetwo-photoncoulduseapproximatelydoubledwavelengthcomparedwithsingle-photon,two-photoncanobviouslypenetrateddeeperintothetissueduetolessscattering(longerwavelength,lessscattering).進口熒光雙光子顯微鏡光子躍遷