細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率低下的幾個(gè)大坑：1.試劑過期有時(shí)候轉(zhuǎn)染效率低下，還要考慮會(huì)不會(huì)存在試劑過期的情況。毛博當(dāng)年做轉(zhuǎn)染整整半年，百思不得其解。較后發(fā)現(xiàn)，原來是Lipofectamine2000過期了。換了之后，立馬成功。根據(jù)我的經(jīng)驗(yàn)，盡量使用開封半年內(nèi)的，因?yàn)檫^了半年后，就算沒有過失效期，但是細(xì)胞毒性較大增加，而轉(zhuǎn)染效率卻較大下降。千萬不要為了省錢，影響實(shí)驗(yàn)進(jìn)度哈。2.未加血清轉(zhuǎn)染后未及時(shí)加入血清，會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞大量死亡。一般要在轉(zhuǎn)染后的4-6小時(shí)換液且換為有血清的培養(yǎng)基。根據(jù)毛博的經(jīng)驗(yàn)，其實(shí)也可以在原來的無血清培養(yǎng)基里面滴加血清。這個(gè)時(shí)候，較好不要換液，不要打擾細(xì)胞，讓它安安靜靜地休息。但是也不能過早加入血清通過實(shí)驗(yàn)優(yōu)化合適的轉(zhuǎn)染條件對(duì)于轉(zhuǎn)染效率的提高很重要。太原正規(guī)細(xì)胞高效轉(zhuǎn)染試劑進(jìn)貨價(jià)

細(xì)胞轉(zhuǎn)染的注意事項(xiàng)：1.細(xì)胞鋪板密度用于轉(zhuǎn)染的較佳細(xì)胞密度根據(jù)不同的細(xì)胞類型或應(yīng)用而異。因轉(zhuǎn)染試劑對(duì)細(xì)胞有毒害作用，細(xì)胞太少，容易死。一般轉(zhuǎn)染時(shí)，貼壁細(xì)胞密度為70%-90%，懸浮細(xì)胞密度為2-4×106細(xì)胞/ml，確保轉(zhuǎn)染時(shí)細(xì)胞沒有長滿或處于靜止期。因?yàn)檗D(zhuǎn)染效率對(duì)細(xì)胞密度很敏感，所以在不同實(shí)驗(yàn)間保持一個(gè)基本的傳代步驟很重要。鋪板細(xì)胞數(shù)目的增加可以增加轉(zhuǎn)染活性和細(xì)胞產(chǎn)量。細(xì)胞的融合度必須要達(dá)到90%才能做啟動(dòng)子的選擇獲得高轉(zhuǎn)染活性所需選擇的啟動(dòng)子依賴于選用的細(xì)胞系和要表達(dá)的蛋白。CMV啟動(dòng)子在大多數(shù)細(xì)胞類型中可以獲得高表達(dá)活性。同其他啟動(dòng)子，如SV40和RSV(勞斯肉瘤細(xì)菌)相比，在BHK-21中其活性較高。這三種細(xì)菌啟動(dòng)子在T細(xì)胞來源的細(xì)胞系，如Jurkat中組成表達(dá)水平較低。轉(zhuǎn)染后在培養(yǎng)基中加入PHA-L和PMA可以啟動(dòng)Jurkat細(xì)胞中CMV啟動(dòng)子，而單PMA就足以啟動(dòng)KG1和K562(人骨髓瘤白細(xì)胞)中的CMV啟動(dòng)子。SV40啟動(dòng)子的表達(dá)在含有大T抗原(存在于COS-1和COS-7)時(shí)會(huì)提高，因?yàn)榇骉抗原可以刺激染色體外的合成。南京正規(guī)細(xì)胞高效轉(zhuǎn)染試劑直銷價(jià)表達(dá)水平與位臵無關(guān)，不會(huì)受到周圍染色體元件的影響。

轉(zhuǎn)染的注意事項(xiàng)：培養(yǎng)基中的物品物品，比如青霉素和鏈霉素，是影響轉(zhuǎn)染的培養(yǎng)基添加物。這些物品一般對(duì)于真核細(xì)胞無毒，但陽離子脂質(zhì)體試劑增加了細(xì)胞的通透性，使物品可以進(jìn)入細(xì)胞。這降低了細(xì)胞的活性，導(dǎo)致轉(zhuǎn)染效率低。所以，在轉(zhuǎn)染培養(yǎng)基中不能使用物品，甚至在準(zhǔn)備轉(zhuǎn)染前進(jìn)行細(xì)胞鋪板時(shí)也要避免使用物品。這樣，在轉(zhuǎn)染前也不必潤洗細(xì)胞。對(duì)于穩(wěn)定轉(zhuǎn)染，不要在選擇性培養(yǎng)基中使用青霉素和鏈霉素，因?yàn)檫@些物品是GENETICIN選擇性物品的競爭性克制劑。另外，為了保證無血清培養(yǎng)基中細(xì)胞的健康生長，使用比含血清培養(yǎng)基更少的物品量。大多數(shù)已建立的細(xì)胞系都是非整倍體，原代培養(yǎng)包括了表達(dá)不同基因組合的細(xì)胞的混合物。細(xì)胞培養(yǎng)在實(shí)驗(yàn)室中保存數(shù)月和數(shù)年后會(huì)經(jīng)歷突變，總?cè)旧w重組或基因調(diào)控變化等而演化，這會(huì)導(dǎo)致和轉(zhuǎn)染相關(guān)的細(xì)胞行為的變化。如果隨時(shí)間發(fā)現(xiàn)這種變化，融化一管新鮮的細(xì)胞可能會(huì)恢復(fù)原先的轉(zhuǎn)染活性。比如，新鮮融化的NIH3T3細(xì)胞比傳代8次的細(xì)胞表現(xiàn)出更高的轉(zhuǎn)染效率，融化細(xì)胞的進(jìn)一步傳代并沒有降低轉(zhuǎn)染效率。因此，如果觀察到轉(zhuǎn)染效率降低，可以試著轉(zhuǎn)染新鮮培養(yǎng)的細(xì)胞以恢復(fù)較佳結(jié)果

細(xì)胞轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)簡介：實(shí)驗(yàn)原理外源基因進(jìn)入細(xì)胞主要有四種方法：電擊法、磷酸鈣法和脂質(zhì)體介導(dǎo)法和細(xì)菌介導(dǎo)法。電擊法是在細(xì)胞上短時(shí)間暫時(shí)性的穿孔讓外源質(zhì)粒進(jìn)入;磷酸鈣法和脂質(zhì)體法是利用不同的載體物質(zhì)攜帶質(zhì)粒通過直接穿膜或者膜融合的方法使得外源基因進(jìn)入細(xì)胞;細(xì)菌法是利用包裝了外源基因的細(xì)菌傳染細(xì)胞的方法使得其進(jìn)入細(xì)胞。但是由于電擊法和磷酸鈣法的實(shí)驗(yàn)條件控制較嚴(yán)、難度較大;細(xì)菌法的前期準(zhǔn)備較復(fù)雜、而且可能對(duì)于細(xì)胞有較大影響;所以現(xiàn)在對(duì)于很多普通細(xì)胞系，一般的瞬時(shí)轉(zhuǎn)染方法多采用脂質(zhì)體法~總?cè)旧w重組或基因調(diào)控變化等而演化。

細(xì)胞轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)的方法有哪些：1..電穿孔法。通過短暫的高電場(chǎng)電脈沖處理細(xì)胞，沿細(xì)胞膜的電壓差異會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞膜的暫時(shí)穿孔。DNA被認(rèn)為是穿過孔擴(kuò)散到細(xì)胞內(nèi)的。電脈沖和場(chǎng)強(qiáng)的優(yōu)化對(duì)于成功的轉(zhuǎn)染非常重要，因?yàn)檫^高的場(chǎng)強(qiáng)和過長的電脈沖時(shí)間會(huì)不可逆地傷害細(xì)胞膜而裂解細(xì)胞。理論上說電穿孔法可用于各種細(xì)胞，且不需要另外采購特殊試劑，但需要昂貴的電轉(zhuǎn)儀。此法每次轉(zhuǎn)染需要更多的細(xì)胞和DNA，因?yàn)榧?xì)胞的死亡率高。每種細(xì)胞電轉(zhuǎn)的條件都需要進(jìn)行多次優(yōu)化。2.細(xì)菌介導(dǎo)的傳染。傳染需要將目的基因克隆到特定的細(xì)菌體系中，經(jīng)過包裝細(xì)胞的包裝得到改造后的細(xì)菌，再進(jìn)行傳染。瞬時(shí)表達(dá)分析所需的人力和時(shí)間比穩(wěn)定表達(dá)少。濟(jì)南正規(guī)細(xì)胞高效轉(zhuǎn)染試劑服務(wù)電話

在瞬時(shí)轉(zhuǎn)染質(zhì)粒中往往都含有一個(gè)報(bào)告基。太原正規(guī)細(xì)胞高效轉(zhuǎn)染試劑進(jìn)貨價(jià)

細(xì)胞轉(zhuǎn)染的注意事項(xiàng)：1.細(xì)胞鋪板密度用于轉(zhuǎn)染的較佳細(xì)胞密度根據(jù)不同的細(xì)胞類型或應(yīng)用而異。因轉(zhuǎn)染試劑對(duì)細(xì)胞有毒害作用，細(xì)胞太少，容易死。一般轉(zhuǎn)染時(shí)，貼壁細(xì)胞密度為70%-90%，懸浮細(xì)胞密度為2-4×106細(xì)胞/ml，確保轉(zhuǎn)染時(shí)細(xì)胞沒有長滿或處于靜止期。因?yàn)檗D(zhuǎn)染效率對(duì)細(xì)胞密度很敏感，所以在不同實(shí)驗(yàn)間保持一個(gè)基本的傳代步驟很重要。鋪板細(xì)胞數(shù)目的增加可以增加轉(zhuǎn)染活性和細(xì)胞產(chǎn)量。細(xì)胞的融合度必須要達(dá)到90%才能做啟動(dòng)子的選擇獲得高轉(zhuǎn)染活性所需選擇的啟動(dòng)子依賴于選用的細(xì)胞系和要表達(dá)的蛋白。CMV啟動(dòng)子在大多數(shù)細(xì)胞類型中可以獲得高表達(dá)活性。同其他啟動(dòng)子，如SV40和RSV(勞斯肉瘤細(xì)菌)相比，在BHK-21中其活性較高。這三種細(xì)菌啟動(dòng)子在T細(xì)胞來源的細(xì)胞系，如Jurkat中組成表達(dá)水平較低。太原正規(guī)細(xì)胞高效轉(zhuǎn)染試劑進(jìn)貨價(jià)