細(xì)胞培養(yǎng)支原體檢測(cè)方法等溫?cái)U(kuò)增
來(lái)源：
發(fā)布時(shí)間：2024-07-11
支原體預(yù)防的實(shí)驗(yàn)步驟主要包括以下幾個(gè)方面：
1. 無(wú)菌操作技術(shù)：在細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中，嚴(yán)格遵守?zé)o菌操作規(guī)程，包括穿戴適當(dāng)?shù)膶?shí)驗(yàn)服、手套，使用無(wú)菌工具和耗材。
2. 環(huán)境控制：保持實(shí)驗(yàn)室環(huán)境清潔，定期消毒工作臺(tái)和實(shí)驗(yàn)室表面，使用層流罩或生物安全柜進(jìn)行細(xì)胞操作。
3. 細(xì)胞培養(yǎng)基和試劑的無(wú)菌過(guò)濾：所有加入到細(xì)胞培養(yǎng)基中的試劑和補(bǔ)充物，如血清、抗*素等，都應(yīng)通過(guò)無(wú)菌過(guò)濾以去除支原體。
4. 細(xì)胞培養(yǎng)基和試劑的檢測(cè)：在添加到細(xì)胞培養(yǎng)物之前，對(duì)新的細(xì)胞培養(yǎng)基和試劑進(jìn)行支原體檢測(cè)，以確保它們沒(méi)有被污染。
5. 定期檢測(cè)：即使采取了預(yù)防措施，也應(yīng)定期對(duì)細(xì)胞培養(yǎng)物進(jìn)行支原體檢測(cè)，以確保及時(shí)發(fā)現(xiàn)并處理潛在的污染。
6. 避免交叉污染：避免從一個(gè)細(xì)胞培養(yǎng)物到另一個(gè)的交叉污染，使用的移液器和工具，避免在不同細(xì)胞培養(yǎng)物之間重復(fù)使用。
7. 細(xì)胞培養(yǎng)物的篩選：使用已知無(wú)支原體污染的細(xì)胞株進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，或者在開(kāi)始實(shí)驗(yàn)前對(duì)細(xì)胞株進(jìn)行篩選。
8. 使用預(yù)防性試劑：在某些情況下，可以在細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中添加特定的預(yù)防性試劑，如支原體預(yù)防劑，以降低污染風(fēng)險(xiǎn)。
科研中常見(jiàn)的支原體檢測(cè)方法？細(xì)胞培養(yǎng)支原體檢測(cè)方法等溫?cái)U(kuò)增
支原體污染和黑膠蟲(chóng)污染是兩種不同類(lèi)型的細(xì)胞培養(yǎng)污染，它們具有各自的特點(diǎn)和區(qū)別：
支原體污染：在相差顯微鏡下，支原體呈暗色微小顆粒位于細(xì)胞表面和細(xì)胞之間。
黑膠蟲(chóng)污染：在高倍鏡下，被黑膠蟲(chóng)污染的細(xì)胞膜會(huì)變得模糊不清，邊界不清晰，有粗糙感。
污染的影響：
支原體污染：可能導(dǎo)致細(xì)胞增殖緩慢，甚至從培養(yǎng)器皿脫落，影響細(xì)胞的DNA、RNA及蛋白表達(dá)。
黑膠蟲(chóng)污染：與細(xì)胞競(jìng)爭(zhēng)性生長(zhǎng)，開(kāi)始時(shí)對(duì)細(xì)胞沒(méi)有什么影響，但當(dāng)數(shù)量多時(shí)，細(xì)胞生長(zhǎng)會(huì)受到影響直至死亡。
污染的來(lái)源：
支原體污染：可能來(lái)源于工作環(huán)境的污染、操作者本身、培養(yǎng)基的污染、交叉污染、實(shí)驗(yàn)器材帶來(lái)的污染以及用來(lái)制備細(xì)胞的原始組織或部位的污染。
黑膠蟲(chóng)污染：可能來(lái)源于細(xì)胞本身的污染或從動(dòng)物取材時(shí)的污染，也可能通過(guò)培養(yǎng)箱空氣進(jìn)行污染。
杭州細(xì)胞支原體預(yù)防支原體污染源和主要類(lèi)型？
檢測(cè)新鮮培養(yǎng)基是否有支原體污染，可以采用以下五種方案：
1. 培養(yǎng)法：這是一種傳統(tǒng)且可靠的方法，通過(guò)將培養(yǎng)基接種到適宜支原體生長(zhǎng)的微生物培養(yǎng)基或瓊脂平板上，觀察是否有支原體生長(zhǎng)。這種方法較為耗時(shí)，但成本較低。
2. 熒光染色法：使用特定的熒光染料（如Hoechst 33258）對(duì)細(xì)胞進(jìn)行染色，然后在熒光顯微鏡下觀察。如果存在支原體污染，可以看到細(xì)胞表面或細(xì)胞間隙中支原體DNA的熒光染色。
3. PCR法：通過(guò)設(shè)計(jì)針對(duì)支原體特定序列的引物，利用PCR技術(shù)特異性擴(kuò)增目標(biāo)DNA。PCR產(chǎn)物通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)，如果出現(xiàn)條帶則表明存在支原體污染。
4. 電鏡觀察法：使用電子顯微鏡直接觀察培養(yǎng)細(xì)胞中的支原體污染情況。這種方法可以提供直觀的支原體形態(tài)信息，但設(shè)備要求較高。
5. 一步法恒溫支原體檢測(cè)：使用特定的試劑盒，如Yeasen一步法恒溫支原體檢測(cè)試劑，采用等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)，通過(guò)顏色變化（由藍(lán)紫色變?yōu)樘焖{(lán)色）進(jìn)行快速檢測(cè)。
細(xì)胞培養(yǎng)中建議使用支原體檢測(cè)的原因主要有以下幾點(diǎn)：
1. 支原體污染率高：常規(guī)細(xì)胞培養(yǎng)中支原體污染率保守估計(jì)在15-35%之間。
2. 影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果：支原體污染會(huì)嚴(yán)重干擾實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可信度，影響培養(yǎng)細(xì)胞的形態(tài)和生理特征。
3. 難以用光學(xué)顯微鏡檢測(cè)：支原體是極小的細(xì)菌，其細(xì)胞膜周?chē)鷽](méi)有細(xì)胞壁，無(wú)法用光學(xué)顯微鏡檢測(cè)到。
4. 難以消滅：支原體能夠迅速滲透整個(gè)實(shí)驗(yàn)室，一旦污染很難徹底消滅。
5. 影響產(chǎn)品質(zhì)量：支原體污染會(huì)影響細(xì)胞培養(yǎng)產(chǎn)物的質(zhì)量，監(jiān)管機(jī)構(gòu)推薦檢測(cè)所有細(xì)胞培養(yǎng)產(chǎn)物中是否存在支原體。
6. 保證實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)確性：定期進(jìn)行支原體檢測(cè)和去除，確保無(wú)支原體存在細(xì)胞培養(yǎng)體系內(nèi)，才能獲得準(zhǔn)確的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。
細(xì)胞培養(yǎng)為什么建議使用支原體檢測(cè)？
支原體是細(xì)胞外生存的 小微生物，是一類(lèi)缺乏細(xì)胞壁的原核細(xì)胞型微生物，大小一般在0.2~0.5um之間，呈高度多形性，有球形、桿形、絲形、分枝狀等多種態(tài)。
1、支原體存在于我們周?chē)赡芫腿鐗m埃一樣存在于我們的環(huán)境中
2、可透過(guò)一般的濾膜，所以不要寄希望于過(guò)濾可以清楚支原體污染的液體
支原體對(duì)培養(yǎng)細(xì)胞的污染發(fā)生率高，據(jù)估計(jì)平均發(fā)生率在60%左右。同時(shí)又非常隱秘，早期不容易被發(fā)現(xiàn)，除非用特異性和靈敏度都非常高的檢測(cè)試劑盒。支原體因?yàn)閭€(gè)頭小，能穿過(guò)0.22微米濾器，并且在實(shí)驗(yàn)室內(nèi)會(huì)潛在的擴(kuò)散。支原體污染使得用被污染的細(xì)胞樣本做的實(shí)驗(yàn)完全失去意義和價(jià)值。
支原體預(yù)防主要是什么成分？深圳細(xì)胞培養(yǎng)支原體檢測(cè)服務(wù)支原體去除的原理是什么？細(xì)胞培養(yǎng)支原體檢測(cè)方法等溫?cái)U(kuò)增
細(xì)胞培養(yǎng)中支原體檢測(cè)出現(xiàn)假陽(yáng)性結(jié)果可能由以下原因引起：
1. 擴(kuò)增產(chǎn)物污染：PCR擴(kuò)增產(chǎn)生的大量DNA拷貝若未妥善處理，極微量的污染就可能導(dǎo)致假陽(yáng)性結(jié)果。
2. 引物設(shè)計(jì)不當(dāng)：引物設(shè)計(jì)不夠特異性，可能會(huì)與非目標(biāo)序列發(fā)生反應(yīng)，導(dǎo)致非特異性擴(kuò)增。
3. 試劑質(zhì)量問(wèn)題：使用的dNTPs、引物、DNA聚合酶等試劑質(zhì)量不佳，可能引起非特異性擴(kuò)增或假陽(yáng)性結(jié)果。
4. 操作技術(shù)問(wèn)題：實(shí)驗(yàn)操作不規(guī)范，如混合樣本、標(biāo)簽錯(cuò)誤或樣本標(biāo)識(shí)不清等，可能導(dǎo)致假陽(yáng)性結(jié)果。
5. PCR反應(yīng)條件設(shè)置不當(dāng)：不恰當(dāng)?shù)腜CR反應(yīng)條件，如溫度和時(shí)間選擇不當(dāng)，可能導(dǎo)致非特異性擴(kuò)增。
6. DNA污染：PCR環(huán)境中的DNA污染會(huì)干擾結(jié)果，導(dǎo)致假陽(yáng)性
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