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南京Co IP免疫沉淀實(shí)驗(yàn)視頻

來(lái)源： 發(fā)布時(shí)間：2024-06-22

免疫沉淀技術(shù)的實(shí)驗(yàn)方法通常包括以下步驟：
1. 樣本準(zhǔn)備
2. 細(xì)胞裂解：使用裂解緩沖液（含有蛋白酶抑制劑以防止蛋白質(zhì)降解）裂解細(xì)胞，釋放蛋白質(zhì)。
3. 蛋白質(zhì)濃度測(cè)定：使用BCA、Bradford或Lowry等方法測(cè)定裂解液中蛋白質(zhì)的濃度。
4. 抗體預(yù)處理：如果使用預(yù)固定的抗體，需先將抗體固定在固相支持物上，如瓊脂糖珠或磁性微珠。
5. 免疫沉淀反應(yīng)：將裂解液與特異性抗體（固定或未固定）混合，并在4°C下緩慢搖晃孵育過(guò)夜，以允許抗體與目標(biāo)蛋白質(zhì)充分結(jié)合。
6. 固相支持物的回收：對(duì)于未固定的抗體，加入與抗體特異性結(jié)合的蛋白A或蛋白G結(jié)合的固相支持物。
7. 洗滌：去除未結(jié)合的蛋白質(zhì)和雜質(zhì)，通常需要多次洗滌固相支持物。
8. 洗脫：使用適當(dāng)?shù)南疵摼彌_液（如加熱的SDS加載緩沖液或酸性緩沖液）從固相支持物上洗脫免疫復(fù)合物。
9. 后續(xù)分析：對(duì)洗脫的蛋白質(zhì)進(jìn)行SDS-PAGE電泳、Western Blot、質(zhì)譜分析等，以進(jìn)一步分析目標(biāo)蛋白質(zhì)。
10. 對(duì)照實(shí)驗(yàn)：包括正對(duì)照（已知能沉淀目標(biāo)蛋白的抗體）和負(fù)對(duì)照（非特異性抗體或無(wú)抗體）以驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)的特異性。
免疫沉淀技術(shù)ChIP的優(yōu)缺點(diǎn)是什么？南京Co IP免疫沉淀實(shí)驗(yàn)視頻

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免疫沉淀ChIP實(shí)驗(yàn)中磁珠還是瓊脂糖珠的選擇取決于客戶(hù)實(shí)驗(yàn)情況。
瓊脂糖珠海綿狀的結(jié)構(gòu)  (直徑 50-150 μm)  可以結(jié)合抗體  (繼而結(jié)合靶蛋白) ，它能夠直接高效、快速結(jié)合抗體，而不需借助特殊的專(zhuān)業(yè)設(shè)備。瓊脂糖珠呈多孔結(jié)構(gòu)，這使得它們擁有更大的表面積可與蛋白質(zhì)相互接觸，具有更高的結(jié)合載量。
與瓊脂糖珠不同，磁珠是固體，抗體的結(jié)合限于磁珠的表面。磁珠 (直徑 1-4 μm) 明顯小于瓊脂糖珠 ，盡管磁珠沒(méi)有多孔中心增加結(jié)合能力，但每體積的磁珠數(shù)量比瓊脂糖珠多，使磁珠擁有足夠的抗體結(jié)合表面積滿(mǎn)足高容量的抗體結(jié)合。
簡(jiǎn)而言之，瓊脂糖珠的結(jié)合能力較強(qiáng)，而磁珠在得率，可重復(fù)性以及自動(dòng)化方面有明顯的優(yōu)勢(shì)。
廣州蛋白免疫沉淀磁珠應(yīng)用免疫沉淀抗體的選擇？

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免疫沉淀RIP實(shí)驗(yàn)中磁珠還是瓊脂糖珠的選擇取決于客戶(hù)實(shí)驗(yàn)情況。
瓊脂糖珠海綿狀的結(jié)構(gòu)  (直徑 50-150 μm)  可以結(jié)合抗體  (繼而結(jié)合靶蛋白) ，它能夠直接高效、快速結(jié)合抗體，而不需借助特殊的專(zhuān)業(yè)設(shè)備。瓊脂糖珠呈多孔結(jié)構(gòu)，這使得它們擁有更大的表面積可與蛋白質(zhì)相互接觸，具有更高的結(jié)合載量。
與瓊脂糖珠不同，磁珠是固體，抗體的結(jié)合限于磁珠的表面。磁珠 (直徑 1-4 μm) 明顯小于瓊脂糖珠 ，盡管磁珠沒(méi)有多孔中心增加結(jié)合能力，但每體積的磁珠數(shù)量比瓊脂糖珠多，使磁珠擁有足夠的抗體結(jié)合表面積滿(mǎn)足高容量的抗體結(jié)合。
簡(jiǎn)而言之，瓊脂糖珠的結(jié)合能力較強(qiáng)，而磁珠在得率，可重復(fù)性以及自動(dòng)化方面有明顯的優(yōu)勢(shì)。

Co-IP（免疫共沉淀）技術(shù)主要用于研究蛋白質(zhì)之間的相互作用，其實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)如下：
1. 樣品準(zhǔn)備：Co-IP實(shí)驗(yàn)通常有兩種，一種是內(nèi)源性蛋白相互作用驗(yàn)證，一種是非內(nèi)源性蛋白相互作用驗(yàn)證。內(nèi)源性相互作用通過(guò)質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染的方式將兩種蛋白轉(zhuǎn)染至同一細(xì)胞內(nèi)表達(dá)；非內(nèi)源性相互作用則是將含有靶蛋白的組織進(jìn)行預(yù)處理及細(xì)胞裂解獲得細(xì)胞裂解液。
2. 沉淀誘餌蛋白：利用磁珠偶聯(lián)抗體沉淀誘餌蛋白。在樣品中加入磁珠偶聯(lián)抗體，抗體會(huì)與誘餌蛋白結(jié)合，利用磁鐵將磁珠拉下，同時(shí)誘餌蛋白會(huì)一起被沉淀出來(lái)。
3. SDS-PAGE及WB檢測(cè)：得到沉淀后，需要驗(yàn)證沉淀中是否存在相互作用蛋白。先利用SDS-PAGE將蛋白復(fù)合物分離，隨后利用WB檢測(cè)是否存在靶蛋白。
4. 實(shí)驗(yàn)對(duì)照設(shè)置：為了避免“假陽(yáng)性”，需要設(shè)置正確的對(duì)照，包括陰性對(duì)照和陽(yáng)性對(duì)照（Input組）。Input組為直接利用抗體對(duì)細(xì)胞裂解液進(jìn)行WB檢測(cè)，驗(yàn)證細(xì)胞裂解液中存在蛋白。
5. 結(jié)果真實(shí)性：確保共沉淀的蛋白是由所加入的抗體沉淀得到的，而并非外源非特異蛋白。使用單克隆抗體有助于避免污染的發(fā)生。
免疫沉淀技術(shù)ChIP的原理是什么？

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免疫沉淀（ChIP）實(shí)驗(yàn)中抗體的選擇非常關(guān)鍵，因?yàn)榭贵w的特異性和親和力直接影響到實(shí)驗(yàn)的成功與否。
1. 特異性：抗體應(yīng)當(dāng)對(duì)目標(biāo)蛋白具有高度的特異性，以避免與其他蛋白發(fā)生非特異性結(jié)合，導(dǎo)致假陽(yáng)性結(jié)果。
2. 親和力：抗體對(duì)目標(biāo)蛋白的親和力要足夠高，以確保在免疫沉淀過(guò)程中能夠有效地捕獲目標(biāo)蛋白。
3. 抗體類(lèi)型：?jiǎn)慰寺】贵w和多克隆抗體都可以用于IP實(shí)驗(yàn)。單克隆抗體提供更高的特異性和批間一致性，而多克隆抗體可能提供更強(qiáng)的結(jié)合能力和更廣的表位覆蓋。
4. 應(yīng)用驗(yàn)證：選擇已經(jīng)過(guò)免疫沉淀（ChIP）或相關(guān)應(yīng)用（如Western blot, IHC）驗(yàn)證的抗體，這增加了實(shí)驗(yàn)成功的可能性。
5. 供應(yīng)商信息：選擇信譽(yù)良好的抗體供應(yīng)商，并查看供應(yīng)商提供的技術(shù)數(shù)據(jù)和客戶(hù)評(píng)價(jià)，以幫助做出決策。
免疫沉淀純化所得抗原量低是什么原因？Protein AG免疫沉淀磁珠現(xiàn)貨

免疫沉淀技術(shù)Co-IP的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)。南京Co IP免疫沉淀實(shí)驗(yàn)視頻

免疫沉淀（RIP）實(shí)驗(yàn)中抗體的選擇非常關(guān)鍵，因?yàn)榭贵w的特異性和親和力直接影響到實(shí)驗(yàn)的成功與否。
1. 特異性：抗體應(yīng)當(dāng)對(duì)目標(biāo)蛋白具有高度的特異性，以避免與其他蛋白發(fā)生非特異性結(jié)合，導(dǎo)致假陽(yáng)性結(jié)果。
2. 親和力：抗體對(duì)目標(biāo)蛋白的親和力要足夠高，以確保在免疫沉淀過(guò)程中能夠有效地捕獲目標(biāo)蛋白。
3. 抗體類(lèi)型：?jiǎn)慰寺】贵w和多克隆抗體都可以用于IP實(shí)驗(yàn)。單克隆抗體提供更高的特異性和批間一致性，而多克隆抗體可能提供更強(qiáng)的結(jié)合能力和更廣的表位覆蓋。
4. 應(yīng)用驗(yàn)證：選擇已經(jīng)過(guò)免疫沉淀（RIP）或相關(guān)應(yīng)用（如Western blot, IHC）驗(yàn)證的抗體，這增加了實(shí)驗(yàn)成功的可能性。
5. 供應(yīng)商信息：選擇信譽(yù)良好的抗體供應(yīng)商，并查看供應(yīng)商提供的技術(shù)數(shù)據(jù)和客戶(hù)評(píng)價(jià)，以幫助做出決策。
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標(biāo)簽： 免疫沉淀 支原體
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