細胞免疫熒光實驗注意事項：根據(jù)所檢測抗原所在位置來確認是否需要加入 Triton 進行通透。若所檢測抗原表位位于膜蛋白的白外段，則不需要通透；一般 5% BSA 封閉即可達到效果；從加熒光二抗起，后面所有操作步驟盡量避光。縮短在熒光顯微鏡下的觀察時間，1~2 h 為宜。染色后盡快熒光顯微鏡下觀察，若不能可放入 4 ℃ 冰箱避光保存一周。無/弱染色：烤片溫度過高，推薦 56~60 ℃ 1~2 h；一抗是否適用固定液和石蠟切片，使用濃度是否過低，孵育是否時間過短等。熒光抗體技術可以用于檢測和定位細胞或組織中的特定抗原物質。collagenX(COL-10)免疫熒光檢查

免疫熒光注意事項：對照實驗的設置：1、內源性組織背景對照：某些細胞和組織可能有固有的生物學性質，會產生背景熒光，對結果產生影響，例如色素脂褐質。因此在孵育一抗前，應對樣品進行觀察，確?？乖旧頉]有信號。2、陽性對照：用確認含有待測抗原的組織或細胞，與待測標本進行統(tǒng)一處理，結果應為陽性，可證明待測抗原有一定活性并且實驗過程中用的試劑及方法均可靠。3、陰性對照：與陽性對照相反，用明確不含有待測抗原的細胞或組織切片染色，結果若為陰性，可排除染色過程中由于非特異性染色造成的假陽性結果。collagenX(COL-10)免疫熒光檢查免疫熒光技術可以用于研究代謝疾病和內分泌系統(tǒng)的功能。

免疫熒光間接法：如檢查未知抗原，先用已知未標記的特異抗體（一抗體）與抗原標本進行反應，用水洗去未反應的抗體，再用標記的抗抗體（第二抗體）與抗原標本反應，使之形成抗體—抗原—抗體復合物，再用水洗去未反應的標記抗體，干燥、封片后鏡檢。如果檢查未知抗體，則表明抗原標本是已知的，待檢血清為一抗體，其它步驟的抗原檢查相同。標記的抗抗體是抗球蛋白抗體，同于血清球蛋白有種的特異性，如免疫抗雞血清球蛋白只對雞的球蛋白發(fā)生反應，因此，制備標記抗體適用于任何抗原的診斷。

熒光的產生：一此化學物質能從外界吸收并儲存能量（如光能、化學能等）而進入激發(fā)態(tài)，當其從激發(fā)態(tài)再回復到基態(tài)時，過剩的能量可以電磁輻射的形式放射（即發(fā)光）。熒光發(fā)射的特點是：可產生熒光的分子或原子在接受能量后即刻引起發(fā)光；而一旦停止供能，發(fā)光（熒光）現(xiàn)象也隨之在瞬間內消失?？梢砸鸢l(fā)熒光的能量種類很多，由光激發(fā)所引起的熒光稱為致熒光。由化學應所引起的稱為化學熒光，由X線或陰極射線引起的分別稱為X線熒光或陰極射線熒光。熒光免疫技術一般應用致熒光物質進行標記。免疫熒光技術利用熒光染料標記的抗體與目標分子結合，從而實現(xiàn)可視化檢測。

免疫熒光實驗步驟：1.樣本準備：細胞或薄組織。對單層生長細胞，在傳代培養(yǎng)時，將細胞接種到預先放置有處理過的蓋玻片的培養(yǎng)皿中，待細胞接近長成單層后取出蓋玻片，PBS洗兩次；對懸浮生長細胞，取對數(shù)生長細胞，用PBS離心洗滌（1000rpm,5min）2次，用細胞離心甩片機制備細胞片或直接制備細胞涂片。2.固定：取適當?shù)墓潭▌┕潭颖?。一般?%PFA固定4℃過夜。固定完畢后的樣本可置于含疊氮納的PBS中4℃保存3個月。3.洗滌：PBS洗滌5min*3次。4.打孔：選擇合適的通透劑處理樣本，目的是使抗體更容易進入細胞與抗原結合。免疫熒光技術可以用于研究免疫系統(tǒng)的功能和異常。CD45免疫熒光IF

免疫熒光技術可以用于研究免疫相關疾病和自身免疫病。collagenX(COL-10)免疫熒光檢查

注意:從加熒光二抗起,后面所有操作步驟都盡量在較暗處進行.DAPI復染核:爬片置于PBS（PH7.4）中在脫色搖床上晃動洗滌3次，每次5min。切片稍甩干后在圈內滴加DAPI染液，避光室溫孵育10min。封片：爬片置于PBS（PH7.4）中在脫色搖床上晃動洗滌3次，每次5min。玻片稍甩干后用抗熒光淬滅封片劑封片。鏡檢拍照：切片于熒光顯微鏡下觀察并采集圖像。（DAPI紫外激發(fā)波長330-380nm，發(fā)射波長420nm，發(fā)藍光；FITC激發(fā)波長465-495nm，發(fā)射波長515-555nm，發(fā)綠光；CY3激發(fā)波長510-560，發(fā)射波長590nm，發(fā)紅光）。兩種抗體同時孵育：由于FIT容易萃滅，因此在孵育抗體時后孵育FITC二抗(孵育二抗一定要避光。collagenX(COL-10)免疫熒光檢查