免疫熒光注意事項：對照實驗的設(shè)置：1、內(nèi)源性組織背景對照：某些細胞和組織可能有固有的生物學(xué)性質(zhì)，會產(chǎn)生背景熒光，對結(jié)果產(chǎn)生影響，例如色素脂褐質(zhì)。因此在孵育一抗前，應(yīng)對樣品進行觀察，確?？乖旧頉]有信號。2、陽性對照：用確認含有待測抗原的組織或細胞，與待測標本進行統(tǒng)一處理，結(jié)果應(yīng)為陽性，可證明待測抗原有一定活性并且實驗過程中用的試劑及方法均可靠。3、陰性對照：與陽性對照相反，用明確不含有待測抗原的細胞或組織切片染色，結(jié)果若為陰性，可排除染色過程中由于非特異性染色造成的假陽性結(jié)果。免疫熒光技術(shù)可以用于研究食品安全和生物安全。PDL-1/CD274免疫熒光染色

細胞的固定及免疫熒光：1)吸除培養(yǎng)基，一般先加入PBS浸洗細胞 3 次，每次 5 min。2)向孔內(nèi)加入4%多聚甲醛1ml，進行細胞固定，室溫固定20分鐘。3)吸去多聚甲醛，使用PBS浸洗 3 次，每次 5 min。4)向孔內(nèi)加入0.5%Triton X-100(PBS配制)室溫通透20min，目的是使細胞通透。5) 除去Triton X-100，使用PBS浸洗 3 次，每次 5 min。6)用10%的與二抗同源的山羊血清(PBS配制)或者5%BSA封閉2小時（選擇的封閉液與后面操作過程中抗體稀釋液一致）。封閉后不需要用PBS清洗。7)吸去封閉液，向每孔滴加足夠量適宜濃度的一抗（一次使用抗體可以根據(jù)抗體說明書推薦濃度，后續(xù)實驗可以摸索抗體的適宜濃度），4℃濕盒內(nèi)孵育過夜。CD45免疫熒光檢查熒光抗體技術(shù)具有高靈敏度和高特異性，可以實現(xiàn)精確的免疫檢測。

細胞免疫熒光簡單實驗步驟如下：1. 漂洗血清蛋白H7、2-7、4 37度 PBS 2小時。2. -20度甲醇固定20分鐘后,自然、干燥 10分鐘。3. PBS洗凈：3min×3。4. 1%Triton：25 min~30 min、配成50 ultriton+5 mlpBS。5. PBS洗凈：2×5 min。6. 羊血清封閉：37度，20分鐘。7. 一抗，4度過夜，一般要大于18小時或者37度，1-2小時。8. 4度PBS洗凈，3 min×5次。9. 二抗37度小于一小時。10. 37度 PBS洗凈，3×5 min。11. 涼干封片（封閉液PH8.5）；不管采用何種方法，在使用PBS緩沖液漂洗時，都要漂洗干凈并且要測下pH值，可以使用PBS多清洗幾次，也可以延長PBS清洗時間，如果結(jié)果背景較高可以延長漂洗的次數(shù)和時。

細胞免疫熒光實驗常見問題:1、信號弱或者無信號：細胞或組織樣本保存時間過長；2）抗體濃度不合適，參照抗體說明書的稀釋濃度，再根據(jù)樣本表達量進行摸索；3）一抗孵育時間不合適，建議 4 ℃ 過夜孵育。2、高背景：封閉不充分；抗體濃度過高；抗體孵育時間過長或溫度過高；清洗不充分；樣本變干，染色過程確保樣品始終浸沒于液體環(huán)境中.3、非特異性染色較多：固定液殘留，這里需要縮短固定時間并且在封閉液中加甘氨酸，并且抗原修復(fù)也可以幫助解決非特異性染色；二抗殘留，二抗需要用帶有吐溫 20 的 PBS 溶解，只要熒光顯微鏡的強度還可以增大，那么就可以增加吐溫洗脫掉非特異性染色。熒光抗體法是利用熒光標記的抗體來追蹤或檢查相應(yīng)抗原的方法。

細胞免疫熒光實驗注意事項：非特異性染色：是否滅活內(nèi)源性過氧化物酶；孵育過程中干片；抗原熱修復(fù)過度。染色過深：一抗?jié)舛冗^高；染色試濃度過高或孵育時間過長；染色劑濃度過高或孵育時間過長。通常實驗室先固定細胞再進行通透，但若檢測抗原是水不溶性蛋白，可先通透再固定，這樣可以通過通透去除一些水溶性蛋白，進而可降低免疫熒光背景和非特異性信號；建議設(shè)陰性對照組，消除由于抗體非特異性結(jié)合而產(chǎn)生的背景染色；選擇醛類固定液時，保持其新鮮度，較好現(xiàn)配現(xiàn)用，使用不新鮮的醛類固定液自發(fā)熒光背景會升高。免疫熒光技術(shù)可以用于研究動物模型和藥物篩選。MYeloperoxidase免疫熒光分析

免疫熒光技術(shù)是一種利用熒光物質(zhì)標記抗體來定位抗原的技術(shù)。PDL-1/CD274免疫熒光染色

細胞的固定及免疫熒光：注意事項：（1）取細胞爬片時，動作應(yīng)輕柔，防止將細胞爬片夾碎，影響實驗進程。（2）種細胞過程中，要注意將細胞輕柔混勻，“八”字或者“十”字形搖晃，防止細胞局部生長過密。（3）稀釋、加二抗（熒光抗體）及此后的洗滌過程中注意避光。（4）細胞爬片進行免疫熒光之后，需要盡快拍照，防止免疫熒光淬滅?；蛘叻庞诎岛袃?nèi)，暫時保存于4度冰箱，盡快拍照。（5）在進行熒光顯微鏡拍照時，要根據(jù)熒光抗體選擇合適的激發(fā)光源。PI/DAPI能將凋亡和未凋亡的細胞都染成紅色/藍色，只在凋亡的細胞核中才有FITC-12-dUTP摻入而定位的綠色熒光。PDL-1/CD274免疫熒光染色