細(xì)胞免疫熒光實(shí)驗(yàn)注意事項(xiàng)：非特異性染色：是否滅活內(nèi)源性過(guò)氧化物酶；孵育過(guò)程中干片；抗原熱修復(fù)過(guò)度。染色過(guò)深：一抗?jié)舛冗^(guò)高；染色試濃度過(guò)高或孵育時(shí)間過(guò)長(zhǎng)；染色劑濃度過(guò)高或孵育時(shí)間過(guò)長(zhǎng)。通常實(shí)驗(yàn)室先固定細(xì)胞再進(jìn)行通透，但若檢測(cè)抗原是水不溶性蛋白，可先通透再固定，這樣可以通過(guò)通透去除一些水溶性蛋白，進(jìn)而可降低免疫熒光背景和非特異性信號(hào)；建議設(shè)陰性對(duì)照組，消除由于抗體非特異性結(jié)合而產(chǎn)生的背景染色；選擇醛類固定液時(shí)，保持其新鮮度，較好現(xiàn)配現(xiàn)用，使用不新鮮的醛類固定液自發(fā)熒光背景會(huì)升高。免疫熒光技術(shù)可以用于研究肉瘤的發(fā)生和發(fā)展過(guò)程。PD-1免疫組化

基于熒光成像的技術(shù)對(duì)于查詢細(xì)胞和組織的結(jié)構(gòu)和功能方面非常有用。當(dāng)與免疫化學(xué)結(jié)合時(shí)，熒光成像技術(shù)的分析能力增加，增強(qiáng)了這種技術(shù)在普遍的研究和臨床應(yīng)用中的實(shí)用性，使其成為寶貴的工具。免疫熒光顯微鏡通過(guò)使活細(xì)胞成像能夠可視化整個(gè)細(xì)胞器，徹底改變了細(xì)胞生物學(xué)領(lǐng)域。免疫組織化學(xué)和免疫細(xì)胞化學(xué)是結(jié)合抗原抗體結(jié)合能力進(jìn)行細(xì)胞分析的常用熒光成像技術(shù)。免疫熒光（IF）是一種強(qiáng)大的免疫染色技術(shù)，利用顯微鏡觀察與靶蛋白和其他目標(biāo)分子結(jié)合的熒光素標(biāo)記抗體。免疫熒光用于鑒定細(xì)胞中的細(xì)胞和組織特異性抗原；可視化蛋白質(zhì)的存在與否、細(xì)胞定位和活化狀態(tài)；并分析免疫反應(yīng)。PD-1免疫組化熒光抗體技術(shù)可以用于檢測(cè)和定位細(xì)胞或組織中的特定抗原物質(zhì)。

免疫熒光固定（防止離體組織自溶抗原擴(kuò)散），固定液包括：有機(jī)溶劑（甲醇、乙醇等）；交聯(lián)劑（4%PFA、10%中性福爾馬林），固定液的選擇取決于被研究抗原的性質(zhì)及所用抗體的特性，不過(guò)，目前甲醛用的還是較多的，但針對(duì)磷酸化的抗體，不適合用甲醛，會(huì)導(dǎo)致磷酸蛋白從膜表面轉(zhuǎn)移到胞漿中，故應(yīng)選擇冰冷的無(wú)水甲醇或無(wú)水乙醇，同時(shí)應(yīng)注意甲醛會(huì)揮發(fā)，在4-8°C不宜儲(chǔ)存太久。固定時(shí)間：取決于組合塊的大小和類型，對(duì)于大多數(shù)組織，18-24h較為理想，細(xì)胞固定時(shí)間較短，一般2%的甲醛室溫固定20min即可。以細(xì)胞樣品為例：用4%的多聚甲醛固定爬片15min，PBS浸洗玻片3次，每次3min。

熒光的產(chǎn)生：一此化學(xué)物質(zhì)能從外界吸收并儲(chǔ)存能量（如光能、化學(xué)能等）而進(jìn)入激發(fā)態(tài)，當(dāng)其從激發(fā)態(tài)再回復(fù)到基態(tài)時(shí)，過(guò)剩的能量可以電磁輻射的形式放射（即發(fā)光）。熒光發(fā)射的特點(diǎn)是：可產(chǎn)生熒光的分子或原子在接受能量后即刻引起發(fā)光；而一旦停止供能，發(fā)光（熒光）現(xiàn)象也隨之在瞬間內(nèi)消失。可以引起發(fā)熒光的能量種類很多，由光激發(fā)所引起的熒光稱為致熒光。由化學(xué)應(yīng)所引起的稱為化學(xué)熒光，由X線或陰極射線引起的分別稱為X線熒光或陰極射線熒光。熒光免疫技術(shù)一般應(yīng)用致熒光物質(zhì)進(jìn)行標(biāo)記。早期的免疫熒光技術(shù)是將抗體與示蹤物質(zhì)結(jié)合，用于定位組織或細(xì)胞內(nèi)的抗原物質(zhì)。

免疫熒光間接法測(cè)抗體實(shí)驗(yàn)步驟：滴加0.01mol/L，pH7.4的PBS于已知抗原標(biāo)本片，10min后棄去，使標(biāo)本片保持一定濕度。滴加以0.01mol/L，pH7.4的PBS適當(dāng)稀釋的待檢抗體標(biāo)本，覆蓋已知抗原標(biāo)本片。將玻片置于有蓋搪瓷盒內(nèi)，37℃保溫30min。取出玻片，置于玻片架上，先用0.01mol/L，pH7.4的PBS沖洗1-2次，然后按順序過(guò)0.01mol/L，pH7.4的PBS三缸浸泡，每缸5min，不時(shí)振蕩。取出玻片，用濾紙吸去多余水分，但不使標(biāo)本干燥，滴加一滴一定稀釋度的熒光標(biāo)記的抗人球蛋白抗體。將玻片平放在有蓋搪瓷盒內(nèi)，37℃保溫30min。重復(fù)操作3。取出玻片，用濾紙吸去多余水分，滴加一滴緩沖甘油，再覆以蓋玻片。熒光顯微鏡高倍視野下觀察，結(jié)果判定同直接法。免疫熒光技術(shù)可以用于研究病毒傳播和免疫應(yīng)答。TLR4免疫

免疫熒光技術(shù)可以用于研究環(huán)境污染和毒物作用。PD-1免疫組化

免疫熒光檢測(cè)相對(duì)于酶檢測(cè)的優(yōu)勢(shì)：定量熒光信號(hào)的能力（與使用基于酶的方法進(jìn)行的定性測(cè)定相反）；復(fù)用能力（可以結(jié)合不同發(fā)射光譜的熒光染料來(lái)檢測(cè)多種蛋白質(zhì)）；熒光染料的光穩(wěn)定性。免疫熒光技術(shù)是根據(jù)抗原抗體反應(yīng)的原理，先將已知的抗原或抗體標(biāo)記上熒光素，制成熒光抗體，再用這種熒光抗體（或抗原）作為探針檢測(cè)組織或細(xì)胞內(nèi)的相應(yīng)抗原（或抗體）。在組織或細(xì)胞內(nèi)形成的抗原抗體復(fù)合物上含有標(biāo)記的熒光素，利用熒光顯微鏡觀察標(biāo)本，熒光素受外來(lái)激發(fā)光的照射而發(fā)生明亮的熒光（黃綠色或橘紅色），可以看見(jiàn)熒光所在的組織細(xì)胞，從而確定抗原或抗體的性質(zhì)、定位，以及利用定量技術(shù)測(cè)定含量。PD-1免疫組化