免疫熒光實驗的注意事項：為了保證熒光染色的正確性，初次試驗時需設(shè)置下述對照，以排除某些非特異性熒光染色的干擾。①標(biāo)本自發(fā)熒光對照：標(biāo)本加1-2滴0.01mol/L，pH7.4的PBS。②特異性對照（抑制試驗）：標(biāo)本加未標(biāo)記的特異性抗體，再加熒光標(biāo)記的特異性抗體。③陽性對照：已知的陽性標(biāo)本加熒光標(biāo)記的特異性抗體。如果標(biāo)本自發(fā)熒光對照和特異性對照呈無熒光或弱熒光，陽性對照和待檢標(biāo)本呈強熒光，則為特異性陽性染色。一般標(biāo)本在高壓汞燈下照射超過3min，就有熒光減弱現(xiàn)象，經(jīng)熒光染色的標(biāo)本較好在當(dāng)天觀察，隨著時間的延長，熒光強度會逐漸下降。免疫熒光技術(shù)是一種以熒光素標(biāo)記抗體來定位抗原物質(zhì)的高度發(fā)達的標(biāo)記免疫技術(shù)。ki67免疫

免疫學(xué)的基本反應(yīng)是抗原-抗體反應(yīng)。由于抗原抗體反應(yīng)具有高度的特異性，所以當(dāng)抗原抗體發(fā)生反應(yīng)時，只要知道其中的一個因素，就可以查出另一個因素。免疫熒光技術(shù)就是將不影響抗原抗體活性的熒光色素標(biāo)記在抗體（或抗原）上，與其相應(yīng)的抗原（或抗體）結(jié)合后，在熒光顯微鏡下呈現(xiàn)一種特異性熒光反應(yīng)。在此基礎(chǔ)上又分為兩種方法：直接法和間接法。直接法：將標(biāo)記的特異性熒光抗體直接加到抗原上，經(jīng)過一定時間反應(yīng)，即可結(jié)合并顯色。間接法：先用抗原的抗體（一抗）與抗原反應(yīng)結(jié)合，再用熒光標(biāo)記的二抗（一抗的抗體）與抗原反應(yīng)，形成抗體-抗原-抗體復(fù)合物。CRT(Calreticulin)免疫熒光試驗熒光抗體技術(shù)可以用于檢測和定位細胞或組織中的特定抗原物質(zhì)。

通過不同顏色熒光標(biāo)記不同的靶標(biāo)，可以直觀的觀察同一樣品細胞內(nèi)不同結(jié)構(gòu)和蛋白。熒光標(biāo)記靶標(biāo)的方法主要包括熒光染料、免疫標(biāo)記、熒光融合蛋白等——這幾種方法均可選擇性標(biāo)記細胞內(nèi)的結(jié)構(gòu)和蛋白，讓您在成像時更輕松地進行觀察。細胞生物學(xué)采用的很多熒光工具基本上都是熒光基團。這些熒光基團經(jīng)過不同的方法修飾或結(jié)合到不同的分子上，從而具備了某些的功能與特定的細胞器或蛋白結(jié)合。通過化學(xué)修飾，單個熒光基團可以產(chǎn)生許多變體形式，且每種變體都有不同的特異性。

熒光效率：熒光分子不會將全部吸收的光能都轉(zhuǎn)變成熒光，總或多或少地以其他形式釋放。熒光效率是指熒光分子將吸收的光能轉(zhuǎn)變成熒光的百分率，與發(fā)射熒光光量子的數(shù)值成正比。熒光效率＝發(fā)射熒光的光量分子數(shù)（熒光強度）／吸收光的光量子數(shù)（激發(fā)光強度）。發(fā)射熒光的光量子數(shù)亦即熒光強度，除受激發(fā)光強度影響外，也與激發(fā)光的波長有關(guān)。各個熒光分子有其特定的吸收光譜和發(fā)射光譜（熒光光譜），即在某一特定波長處有較大吸收峰和較大發(fā)射峰。選擇激發(fā)光波長量接近于熒光分子的較大吸收峰波長，且測定光波量接近于較大發(fā)射光波峰時，得到的熒光強度也較大。免疫熒光技術(shù)是基于免疫學(xué)、生物化學(xué)和顯微鏡技術(shù)的重要方法之一。

免疫熒光技術(shù)的主要特點是：特異性強、敏感性高、速度快。主要缺點是：非特異性染色問題尚未完全解決，結(jié)果判定的客觀性不足，技術(shù)程序也還比較復(fù)雜。熒光免疫法按反應(yīng)體系及定量方法不同，還可進一步分做若干種。與放射免疫法相比，熒光免疫法無放射性污染，并且大多操作簡便，便于推廣。國外生產(chǎn)的TDM用試劑盒，有相當(dāng)一部分即屬于此類，并且還有TDM熒光偏振免疫分析用的自動分析儀生產(chǎn)。由于一般熒光測定中的本底較高等問題，熒光免疫技術(shù)用于定量測定有一定困難。新發(fā)展了幾種特殊的熒光免疫測定，與酶免疫測定和放射免疫分析一樣，在臨床檢驗中應(yīng)用。免疫熒光技術(shù)可以用于研究神經(jīng)系統(tǒng)的功能和疾病。CTNT免疫檢測

在實際工作中，熒光抗原技術(shù)應(yīng)用較少，因此通常將其稱為熒光抗體技術(shù)或免疫熒光技術(shù)。ki67免疫

免疫熒光檢測相對于酶檢測的優(yōu)勢：定量熒光信號的能力（與使用基于酶的方法進行的定性測定相反）；復(fù)用能力（可以結(jié)合不同發(fā)射光譜的熒光染料來檢測多種蛋白質(zhì)）；熒光染料的光穩(wěn)定性。免疫熒光技術(shù)是根據(jù)抗原抗體反應(yīng)的原理，先將已知的抗原或抗體標(biāo)記上熒光素，制成熒光抗體，再用這種熒光抗體（或抗原）作為探針檢測組織或細胞內(nèi)的相應(yīng)抗原（或抗體）。在組織或細胞內(nèi)形成的抗原抗體復(fù)合物上含有標(biāo)記的熒光素，利用熒光顯微鏡觀察標(biāo)本，熒光素受外來激發(fā)光的照射而發(fā)生明亮的熒光（黃綠色或橘紅色），可以看見熒光所在的組織細胞，從而確定抗原或抗體的性質(zhì)、定位，以及利用定量技術(shù)測定含量。ki67免疫