免疫熒光通透（目的是使抗體進入胞內(nèi)），0.5%TritonX-100(一種去垢劑，用PBS配制)室溫通透20min（針對胞內(nèi)抗原，若是細胞膜上表達的抗原則省略該步驟）；除了TritonX-100，也可作為通透劑，并且固定后的樣品不需要通透。封閉（減少一抗和二抗與非特異位點進行結合），通透后用PBS浸洗玻片3次，每次3min，吸水紙吸干PBS，在玻片上滴加山羊血清，室溫封閉30min。常用的封閉液包括：與二抗同一來源的血清、BSA或者是羊血清。從封閉開始所有的步驟，一定要注意樣品的保濕，避免樣品的干燥，否則極易產(chǎn)生較高的背景。醛類固定的樣品，在用一抗孵育前用含0.3M甘氨酸的封閉液進行封閉。免疫熒光技術可以用于研究疾病的發(fā)生機制和醫(yī)治效果評估。F4/80免疫熒光

細胞的固定及免疫熒光：1)吸除培養(yǎng)基，一般先加入PBS浸洗細胞 3 次，每次 5 min。2)向孔內(nèi)加入4%多聚甲醛1ml，進行細胞固定，室溫固定20分鐘。3)吸去多聚甲醛，使用PBS浸洗 3 次，每次 5 min。4)向孔內(nèi)加入0.5%Triton X-100(PBS配制)室溫通透20min，目的是使細胞通透。5) 除去Triton X-100，使用PBS浸洗 3 次，每次 5 min。6)用10%的與二抗同源的山羊血清(PBS配制)或者5%BSA封閉2小時（選擇的封閉液與后面操作過程中抗體稀釋液一致）。封閉后不需要用PBS清洗。7)吸去封閉液，向每孔滴加足夠量適宜濃度的一抗（一次使用抗體可以根據(jù)抗體說明書推薦濃度，后續(xù)實驗可以摸索抗體的適宜濃度），4℃濕盒內(nèi)孵育過夜。F4/80免疫熒光免疫熒光技術中，以熒光物質(zhì)標記抗體來定位抗原物質(zhì)的方法被稱為熒光抗體技術。

其他熒光物質(zhì)：酶作用后產(chǎn)生熒光的物質(zhì)某些化合物本身無熒光效應，一旦經(jīng)酶作用便形成具有強熒光的物質(zhì)。例如4-甲基傘酮-β-D半乳糖苷受β-半乳糖苷酶的作用分解成4-甲基傘酮，后者可發(fā)出熒光，激發(fā)光波長為360nm，發(fā)射光波長為450nm。其他如堿性酸酶的底物4-甲基傘酮磷酸鹽和辣根過氧化物酶的底物對羥基乙酸等。鑭系螯合物某些3價稀土鑭系元素如銪（Eu3）、鋱（Tb3）、鈰（Ce3）等的螯合物經(jīng)激發(fā)后也可發(fā)射特征性的熒光，其中以Eu3應用較廣。Eu3螯合物的激發(fā)光波長范圍寬，發(fā)射光波長范圍窄，熒光衰變時間長，較適合用于分辨熒光免疫測定。

細胞的固定及免疫熒光：注意事項：（1）取細胞爬片時，動作應輕柔，防止將細胞爬片夾碎，影響實驗進程。（2）種細胞過程中，要注意將細胞輕柔混勻，“八”字或者“十”字形搖晃，防止細胞局部生長過密。（3）稀釋、加二抗（熒光抗體）及此后的洗滌過程中注意避光。（4）細胞爬片進行免疫熒光之后，需要盡快拍照，防止免疫熒光淬滅。或者放于暗盒內(nèi)，暫時保存于4度冰箱，盡快拍照。（5）在進行熒光顯微鏡拍照時，要根據(jù)熒光抗體選擇合適的激發(fā)光源。PI/DAPI能將凋亡和未凋亡的細胞都染成紅色/藍色，只在凋亡的細胞核中才有FITC-12-dUTP摻入而定位的綠色熒光。免疫熒光技術可以用于研究藥物的靶點和作用機制。

免疫熒光實驗的注意事項：對熒光標記的抗體的稀釋，要保證抗體的蛋白有一定的濃度，一般稀釋度不應超過1：20，抗體濃度過低，會導致產(chǎn)生的熒光過弱，影響結果的觀察。染色的溫度和時間需要根據(jù)各種不同的標本及抗原而變化，染色時間可以從10min到數(shù)小時，一般30min已足夠。染色溫度多采用室溫（25℃左右），高于37℃可加強染色效果，但對不耐熱的抗原（如流行性乙型腦炎病毒）可采用0-2℃的低溫，延長染色時間。低溫染色過夜較37℃30min效果好的多。免疫熒光技術可以用于研究環(huán)境污染和毒物作用。F4/80免疫熒光

熒光抗體法是利用熒光標記的抗體來追蹤或檢查相應抗原的方法。F4/80免疫熒光

免疫熒光應用范圍：其應用范圍極其普遍，可以測定內(nèi)分泌、蛋白質(zhì)、細胞因子、細胞表面抗原、多肽、核酸、受體、神經(jīng)遞質(zhì)、肉瘤標志物、血藥濃度等各種生物活性物質(zhì)。根據(jù)診斷類別，又可分為傳染性疾病、內(nèi)分泌、藥物檢測、免疫學、血型鑒定等。免疫熒光實驗步驟：洗滌：PBS洗滌5min*3次。封閉：使用封閉液對樣本進行封閉，一般1h。加一抗：使用合適濃度的一抗與樣本4℃過夜。洗滌：PBS或PBST洗滌5min*3次。加二抗：使用間接法時需要加二抗處理，根據(jù)說明書使用合適的濃度，避光處理1h（后面步驟均需避光）。洗滌：PBS或PBST洗滌5min*3次。封片：滴一滴防淬滅劑，封片。可立即觀察后暫存4℃盡快觀察。F4/80免疫熒光