細(xì)胞免疫熒光實(shí)驗(yàn)常見問題:1、信號弱或者無信號：細(xì)胞或組織樣本保存時間過長；2）抗體濃度不合適，參照抗體說明書的稀釋濃度，再根據(jù)樣本表達(dá)量進(jìn)行摸索；3）一抗孵育時間不合適，建議 4 ℃ 過夜孵育。2、高背景：封閉不充分；抗體濃度過高；抗體孵育時間過長或溫度過高；清洗不充分；樣本變干，染色過程確保樣品始終浸沒于液體環(huán)境中.3、非特異性染色較多：固定液殘留，這里需要縮短固定時間并且在封閉液中加甘氨酸，并且抗原修復(fù)也可以幫助解決非特異性染色；二抗殘留，二抗需要用帶有吐溫 20 的 PBS 溶解，只要熒光顯微鏡的強(qiáng)度還可以增大，那么就可以增加吐溫洗脫掉非特異性染色。免疫熒光技術(shù)在生物學(xué)研究、醫(yī)學(xué)診斷和藥物開發(fā)等領(lǐng)域具有普遍應(yīng)用。GFP免疫組化

免疫熒光應(yīng)用范圍：其應(yīng)用范圍極其普遍，可以測定內(nèi)分泌、蛋白質(zhì)、多肽、核酸、神經(jīng)遞質(zhì)、受體、細(xì)胞因子、細(xì)胞表面抗原、肉瘤標(biāo)志物、血藥濃度等各種生物活性物質(zhì)。根據(jù)診斷類別，又可分為傳染性疾病、內(nèi)分泌、藥物檢測、免疫學(xué)、血型鑒定等。許多物質(zhì)都可產(chǎn)生熒光現(xiàn)象，但并非都可用作熒光色素。只有那些能產(chǎn)生明顯的熒光并能作為染料使用的有機(jī)化合物才能稱為免疫熒光色素或熒光染料。異硫氰酸熒光素為黃色或橙黃色結(jié)晶粉末，易溶于水或酒精等溶劑。分子量為389.4，較大吸收光波長為490495nm，較大發(fā)射光波長520530nm，呈現(xiàn)明亮的黃綠色熒光。VEGFA免疫熒光分析免疫熒光技術(shù)是基于免疫學(xué)、生物化學(xué)和顯微鏡技術(shù)的重要方法之一。

細(xì)胞爬片的免疫熒光步驟基本一致：1. 取出細(xì)胞爬片放到35mm或60mm用過的細(xì)胞培養(yǎng)皿里，PBS洗三遍。注意：有的時候作的細(xì)胞爬片可能比較小，因此夾取的時候要小心，注意 反正面，放在皿里洗比較方便，避免了來回夾取，另外洗的時候加PBS不要太沖，不要細(xì)胞沖下來。洗的時候我都是多加PBS，稍晃一下就倒掉，沒有等5分鐘或10分鐘。2. 4%冷的多聚甲醛固定20分鐘，PBS洗三遍。3. 0.2%Triton X-100通透10分鐘，PBS洗三遍。4. 與二抗相同宿主的血清封閉30分鐘，PBS洗三遍。5. 一抗4度濕盒內(nèi)過夜，也可37度2小時，感覺前者效果好，PBS洗三遍。6. 二抗室溫2小時(避光)，或者37度1半小時，PBS洗三遍。7. 較好用DAPI染核，然后直接照熒光片。8. 蒸餾水洗掉PBS，甘油封片，指甲油封片子的四周，因?yàn)楦视筒幌髽渲菢訒?，所以不用指甲油封的話會弄的一塌糊涂?/p>

細(xì)胞的固定及免疫熒光：1)吸除培養(yǎng)基，一般先加入PBS浸洗細(xì)胞 3 次，每次 5 min。2)向孔內(nèi)加入4%多聚甲醛1ml，進(jìn)行細(xì)胞固定，室溫固定20分鐘。3)吸去多聚甲醛，使用PBS浸洗 3 次，每次 5 min。4)向孔內(nèi)加入0.5%Triton X-100(PBS配制)室溫通透20min，目的是使細(xì)胞通透。5) 除去Triton X-100，使用PBS浸洗 3 次，每次 5 min。6)用10%的與二抗同源的山羊血清(PBS配制)或者5%BSA封閉2小時（選擇的封閉液與后面操作過程中抗體稀釋液一致）。封閉后不需要用PBS清洗。7)吸去封閉液，向每孔滴加足夠量適宜濃度的一抗（一次使用抗體可以根據(jù)抗體說明書推薦濃度，后續(xù)實(shí)驗(yàn)可以摸索抗體的適宜濃度），4℃濕盒內(nèi)孵育過夜。使用熒光抗體方法是免疫熒光技術(shù)中常見的操作步驟。

熒光的猝滅：熒光分子的輻射能力在受到激發(fā)光較長時間的照射后會減弱甚至猝滅，這是由于激發(fā)態(tài)分子的電子不能回復(fù)到基態(tài)，所吸收的能量無法以熒光的形式發(fā)射。一些化合物有天然的熒光猝滅作用而被用作猝滅劑，以消除不需用的熒光。因此熒光物質(zhì)的保存應(yīng)注意避免光（特別是紫外光）的直接照射和與其他化合物的接觸。在熒光抗體技術(shù)中常用一些非熒的色素物質(zhì)如亞甲藍(lán)、堿性復(fù)紅。伊文思藍(lán)或低濃度的過錳酸鉀、碘溶液等對標(biāo)本進(jìn)行得當(dāng)復(fù)染，以減弱非特異性熒光本質(zhì)，使特異熒光更突出顯示。在1941年，Coons初次成功地使用熒光素作為標(biāo)記物質(zhì)進(jìn)行免疫熒光實(shí)驗(yàn)。Vimentin免疫熒光分析

免疫熒光技術(shù)可以用于研究藥物的靶點(diǎn)和作用機(jī)制。GFP免疫組化

免疫熒光間接法：如檢查未知抗原，先用已知未標(biāo)記的特異抗體（一抗體）與抗原標(biāo)本進(jìn)行反應(yīng)，用水洗去未反應(yīng)的抗體，再用標(biāo)記的抗抗體（第二抗體）與抗原標(biāo)本反應(yīng)，使之形成抗體—抗原—抗體復(fù)合物，再用水洗去未反應(yīng)的標(biāo)記抗體，干燥、封片后鏡檢。如果檢查未知抗體，則表明抗原標(biāo)本是已知的，待檢血清為一抗體，其它步驟的抗原檢查相同。標(biāo)記的抗抗體是抗球蛋白抗體，同于血清球蛋白有種的特異性，如免疫抗雞血清球蛋白只對雞的球蛋白發(fā)生反應(yīng)，因此，制備標(biāo)記抗體適用于任何抗原的診斷。GFP免疫組化