免疫熒光實(shí)驗(yàn)步驟：1.樣本準(zhǔn)備：細(xì)胞或薄組織。對(duì)單層生長(zhǎng)細(xì)胞，在傳代培養(yǎng)時(shí)，將細(xì)胞接種到預(yù)先放置有處理過(guò)的蓋玻片的培養(yǎng)皿中，待細(xì)胞接近長(zhǎng)成單層后取出蓋玻片，PBS洗兩次；對(duì)懸浮生長(zhǎng)細(xì)胞，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)細(xì)胞，用PBS離心洗滌（1000rpm,5min）2次，用細(xì)胞離心甩片機(jī)制備細(xì)胞片或直接制備細(xì)胞涂片。2.固定：取適當(dāng)?shù)墓潭▌┕潭颖?。一般?%PFA固定4℃過(guò)夜。固定完畢后的樣本可置于含疊氮納的PBS中4℃保存3個(gè)月。3.洗滌：PBS洗滌5min*3次。4.打孔：選擇合適的通透劑處理樣本，目的是使抗體更容易進(jìn)入細(xì)胞與抗原結(jié)合。免疫熒光技術(shù)在免疫學(xué)研究中發(fā)揮重要作用，幫助揭示細(xì)胞和分子的功能和相互關(guān)系。F4/80免疫熒光IF

免疫熒光檢測(cè)相對(duì)于酶檢測(cè)的優(yōu)勢(shì)：定量熒光信號(hào)的能力（與使用基于酶的方法進(jìn)行的定性測(cè)定相反）；復(fù)用能力（可以結(jié)合不同發(fā)射光譜的熒光染料來(lái)檢測(cè)多種蛋白質(zhì)）；熒光染料的光穩(wěn)定性。免疫熒光技術(shù)是根據(jù)抗原抗體反應(yīng)的原理，先將已知的抗原或抗體標(biāo)記上熒光素，制成熒光抗體，再用這種熒光抗體（或抗原）作為探針檢測(cè)組織或細(xì)胞內(nèi)的相應(yīng)抗原（或抗體）。在組織或細(xì)胞內(nèi)形成的抗原抗體復(fù)合物上含有標(biāo)記的熒光素，利用熒光顯微鏡觀察標(biāo)本，熒光素受外來(lái)激發(fā)光的照射而發(fā)生明亮的熒光（黃綠色或橘紅色），可以看見(jiàn)熒光所在的組織細(xì)胞，從而確定抗原或抗體的性質(zhì)、定位，以及利用定量技術(shù)測(cè)定含量。F4/80免疫熒光IF免疫熒光技術(shù)利用熒光染料標(biāo)記的抗體與目標(biāo)分子結(jié)合，從而實(shí)現(xiàn)可視化檢測(cè)。

細(xì)胞的固定及免疫熒光：注意事項(xiàng)：（1）取細(xì)胞爬片時(shí)，動(dòng)作應(yīng)輕柔，防止將細(xì)胞爬片夾碎，影響實(shí)驗(yàn)進(jìn)程。（2）種細(xì)胞過(guò)程中，要注意將細(xì)胞輕柔混勻，“八”字或者“十”字形搖晃，防止細(xì)胞局部生長(zhǎng)過(guò)密。（3）稀釋、加二抗（熒光抗體）及此后的洗滌過(guò)程中注意避光。（4）細(xì)胞爬片進(jìn)行免疫熒光之后，需要盡快拍照，防止免疫熒光淬滅?；蛘叻庞诎岛袃?nèi)，暫時(shí)保存于4度冰箱，盡快拍照。（5）在進(jìn)行熒光顯微鏡拍照時(shí)，要根據(jù)熒光抗體選擇合適的激發(fā)光源。PI/DAPI能將凋亡和未凋亡的細(xì)胞都染成紅色/藍(lán)色，只在凋亡的細(xì)胞核中才有FITC-12-dUTP摻入而定位的綠色熒光。

免疫熒光間接法測(cè)抗體實(shí)驗(yàn)步驟：滴加0.01mol/L，pH7.4的PBS于已知抗原標(biāo)本片，10min后棄去，使標(biāo)本片保持一定濕度。滴加以0.01mol/L，pH7.4的PBS適當(dāng)稀釋的待檢抗體標(biāo)本，覆蓋已知抗原標(biāo)本片。將玻片置于有蓋搪瓷盒內(nèi)，37℃保溫30min。取出玻片，置于玻片架上，先用0.01mol/L，pH7.4的PBS沖洗1-2次，然后按順序過(guò)0.01mol/L，pH7.4的PBS三缸浸泡，每缸5min，不時(shí)振蕩。取出玻片，用濾紙吸去多余水分，但不使標(biāo)本干燥，滴加一滴一定稀釋度的熒光標(biāo)記的抗人球蛋白抗體。將玻片平放在有蓋搪瓷盒內(nèi)，37℃保溫30min。重復(fù)操作3。取出玻片，用濾紙吸去多余水分，滴加一滴緩沖甘油，再覆以蓋玻片。熒光顯微鏡高倍視野下觀察，結(jié)果判定同直接法。熒光抗體標(biāo)記使得抗原定位變得可視化，有助于觀察細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能。

免疫熒光的原理和類型：免疫熒光利用熒光分子或熒光團(tuán)在一定波長(zhǎng)（分子的吸收光譜）下吸收光子的特性，經(jīng)過(guò)短暫的間隔（發(fā)射光譜）后以較高的波長(zhǎng)發(fā)射光子，并伴隨能量損失。發(fā)射的熒光可通過(guò)顯微鏡觀察到。熒光團(tuán)可以通過(guò)可見(jiàn)光或紫外光激發(fā)。具有高光穩(wěn)定性和熒光量子產(chǎn)率的熒光染料可在市場(chǎng)上購(gòu)買，其激發(fā)較大值跨越從400到>700nm的波長(zhǎng)范圍。它們不會(huì)損傷活細(xì)胞，可安全用于生物制劑。在進(jìn)行免疫熒光檢測(cè)時(shí)，首先對(duì)細(xì)胞或組織進(jìn)行固定和透化處理。進(jìn)行免疫染色時(shí)，熒光團(tuán)與目標(biāo)抗原的抗體結(jié)合，然后使用成像顯微鏡觀察熒光信號(hào)。根據(jù)使用的抗體和所需的信號(hào)擴(kuò)增，免疫熒光可分為直接和間接兩種類型。免疫熒光技術(shù)在生物醫(yī)學(xué)研究中具有普遍的應(yīng)用前景。F4/80免疫熒光IF

免疫熒光技術(shù)可以用于研究動(dòng)物模型和藥物篩選。F4/80免疫熒光IF

免疫熒光技術(shù)的主要特點(diǎn)是：特異性強(qiáng)、敏感性高、速度快。主要缺點(diǎn)是：非特異性染色問(wèn)題尚未完全解決，結(jié)果判定的客觀性不足，技術(shù)程序也還比較復(fù)雜。熒光免疫法按反應(yīng)體系及定量方法不同，還可進(jìn)一步分做若干種。與放射免疫法相比，熒光免疫法無(wú)放射性污染，并且大多操作簡(jiǎn)便，便于推廣。國(guó)外生產(chǎn)的TDM用試劑盒，有相當(dāng)一部分即屬于此類，并且還有TDM熒光偏振免疫分析用的自動(dòng)分析儀生產(chǎn)。由于一般熒光測(cè)定中的本底較高等問(wèn)題，熒光免疫技術(shù)用于定量測(cè)定有一定困難。新發(fā)展了幾種特殊的熒光免疫測(cè)定，與酶免疫測(cè)定和放射免疫分析一樣，在臨床檢驗(yàn)中應(yīng)用。F4/80免疫熒光IF