細胞的固定及免疫熒光：吸去一抗，使用PBS浸洗 3 次，每次 5 min。向孔內滴加足夠量適宜濃度的二抗，37℃，室溫避光孵育1小時。注意二抗帶有熒光素標記，因此操作過程盡量在暗處進行。吸去二抗，使用PBS浸洗 3 次，每次 5 min。向玻片上滴加DAPI，或者Hoechst復染細胞核，一般為藍色熒光；避光孵育5-10min。使用PBS輕洗細胞3 次，每次 5 min，洗去多余的DAPI。取爬片時由于爬片與培養(yǎng)皿底結合較緊，張力較大，可將注射器針頭針尖向背面做個小鉤，這樣將爬片輕輕勾起，用小鑷子取出即可。用吸水紙吸干爬片上的液體，用含抗熒光淬滅劑的封片液封片，注意將爬片反過來貼于多聚賴氨酸載玻片上，然后在熒光顯微鏡下觀察并采集圖像，注意選擇抗體對應的激發(fā)光源。熒光抗原法是利用已知的熒光標記物來追蹤或檢查相應抗體的方法。PDL-1/CD274免疫檢測

細胞的固定及免疫熒光：注意事項：（1）取細胞爬片時，動作應輕柔，防止將細胞爬片夾碎，影響實驗進程。（2）種細胞過程中，要注意將細胞輕柔混勻，“八”字或者“十”字形搖晃，防止細胞局部生長過密。（3）稀釋、加二抗（熒光抗體）及此后的洗滌過程中注意避光。（4）細胞爬片進行免疫熒光之后，需要盡快拍照，防止免疫熒光淬滅?；蛘叻庞诎岛袃?，暫時保存于4度冰箱，盡快拍照。（5）在進行熒光顯微鏡拍照時，要根據熒光抗體選擇合適的激發(fā)光源。PI/DAPI能將凋亡和未凋亡的細胞都染成紅色/藍色，只在凋亡的細胞核中才有FITC-12-dUTP摻入而定位的綠色熒光。CD86免疫組化免疫熒光技術可以用于研究藥物的靶點和作用機制。

免疫熒光-實驗步驟：細胞爬片免疫熒光：在培養(yǎng)板中將已爬好細胞的玻片用PBS浸洗3次,每次5min;（圓蓋片：13mm24孔；18mm12孔；20mm6孔）用4%的多聚甲醛固定爬片15min,PBS浸洗玻片3次,每次5min0.5%TritonX-100(PBS配制)室溫通透20min(細胞膜上表達的抗原省略此步驟);PBS浸洗玻片3次,每次3min,吸水紙吸干PBS,在玻片上滴加3%的BSA（PBS配置）,室溫封閉30min5,吸水紙吸掉封閉液,不洗,每張玻片滴加足夠量用PBS稀釋好的一抗并放入濕盒,4℃孵育過夜。加熒光二抗:PBS浸洗爬片3次,每次5min,吸水紙吸干爬片上多余液體后滴加稀釋好的熒光二抗,濕盒中室溫孵育50min。

細胞和組織樣品處理：準備熒光標記的細胞樣品：為實現(xiàn)較佳的圖像質量，首先應建立針對目的蛋白和細胞結構的研究，同時將其他一切背景等排除在圖像之外。固定和破膜細胞樣品用于標記–首先將細胞結構、蛋白和核酸固定，然后使熒光染料和抗體滲入到細胞內部，標記目的靶點。封閉細胞樣品，防止熒光標記物與研究無關的蛋白非特異性結合，較大限度提高信噪比。蛋白封閉液有助于減少非特異染色。抗體能夠取代封閉蛋白與其表位形成高親和力結合，而封閉液可防止樣品中的低親和力結合。熒光抗體技術可用于檢測和定位各種抗原，也可以用于檢測和定位抗體。

免疫熒光實驗的注意事項：對熒光標記的抗體的稀釋，要保證抗體的蛋白有一定的濃度，一般稀釋度不應超過1：20，抗體濃度過低，會導致產生的熒光過弱，影響結果的觀察。染色的溫度和時間需要根據各種不同的標本及抗原而變化，染色時間可以從10min到數小時，一般30min已足夠。染色溫度多采用室溫（25℃左右），高于37℃可加強染色效果，但對不耐熱的抗原（如流行性乙型腦炎病毒）可采用0-2℃的低溫，延長染色時間。低溫染色過夜較37℃30min效果好的多。免疫熒光技術是將抗體與熒光素等示蹤物質結合，通過抗原抗體反應進行定位。PDX-1免疫組化

免疫熒光是一種常用的生物學實驗技術，用于檢測和定位特定抗原或抗體。PDL-1/CD274免疫檢測

注意:從加熒光二抗起,后面所有操作步驟都盡量在較暗處進行.DAPI復染核:爬片置于PBS（PH7.4）中在脫色搖床上晃動洗滌3次，每次5min。切片稍甩干后在圈內滴加DAPI染液，避光室溫孵育10min。封片：爬片置于PBS（PH7.4）中在脫色搖床上晃動洗滌3次，每次5min。玻片稍甩干后用抗熒光淬滅封片劑封片。鏡檢拍照：切片于熒光顯微鏡下觀察并采集圖像。（DAPI紫外激發(fā)波長330-380nm，發(fā)射波長420nm，發(fā)藍光；FITC激發(fā)波長465-495nm，發(fā)射波長515-555nm，發(fā)綠光；CY3激發(fā)波長510-560，發(fā)射波長590nm，發(fā)紅光）。兩種抗體同時孵育：由于FIT容易萃滅，因此在孵育抗體時后孵育FITC二抗(孵育二抗一定要避光。PDL-1/CD274免疫檢測

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