熒光標記二抗的選擇普遍；與使用熒光素結合一抗的檢測相比，成本較低。間接免疫熒光的缺點：由于需要具有兩種不同物種反應性的兩種抗體，因此物種交叉反應性問題增加；與直接免疫熒光相比，時間更長（操作步驟更多）。間接免疫熒光的優(yōu)點：通過增加能夠與一抗結合的二抗數(shù)量進行信號放大；與直接免疫熒光相比，通過信號放大提高檢測靈敏度；熒光標記二抗的選擇普遍；與使用熒光素結合一抗的檢測相比，成本較低。間接免疫熒光的缺點：由于需要具有兩種不同物種反應性的兩種抗體，因此物種交叉反應性問題增加；與直接免疫熒光相比，時間更長（操作步驟更多）。免疫熒光技術可以用于研究細胞分裂和細胞周期。Aggrecan免疫

細胞免疫熒光可以觀察蛋白在細胞中的定位，以及一些特殊信號分子蛋白的出核/入核的定位變化。在進行細胞免疫熒光過程中，需要用到細胞爬片，通過將爬片浸在細胞培養(yǎng)基內(nèi)，細胞在爬片上生長，進而進行細胞的免疫熒光。實驗前準備：1.胰酶;2.DMEM細胞培養(yǎng)基;3.細胞培養(yǎng)12孔板或者6孔板;4.爬片。間接免疫熒光的優(yōu)點：通過增加能夠與一抗結合的二抗數(shù)量進行信號放大；與直接免疫熒光相比，通過信號放大提高檢測靈敏度。免疫熒光技術是一種以熒光素標記抗體來定位抗原物質(zhì)的高度發(fā)達的標記免疫技術。P21免疫檢測熒光抗原法是利用已知的熒光標記物來追蹤或檢查相應抗體的方法。

免疫熒光檢測相對于酶檢測的優(yōu)勢：定量熒光信號的能力（與使用基于酶的方法進行的定性測定相反）；復用能力（可以結合不同發(fā)射光譜的熒光染料來檢測多種蛋白質(zhì)）；熒光染料的光穩(wěn)定性。免疫熒光技術是根據(jù)抗原抗體反應的原理，先將已知的抗原或抗體標記上熒光素，制成熒光抗體，再用這種熒光抗體（或抗原）作為探針檢測組織或細胞內(nèi)的相應抗原（或抗體）。在組織或細胞內(nèi)形成的抗原抗體復合物上含有標記的熒光素，利用熒光顯微鏡觀察標本，熒光素受外來激發(fā)光的照射而發(fā)生明亮的熒光（黃綠色或橘紅色），可以看見熒光所在的組織細胞，從而確定抗原或抗體的性質(zhì)、定位，以及利用定量技術測定含量。

細胞的固定及免疫熒光：1)吸除培養(yǎng)基，一般先加入PBS浸洗細胞 3 次，每次 5 min。2)向孔內(nèi)加入4%多聚甲醛1ml，進行細胞固定，室溫固定20分鐘。3)吸去多聚甲醛，使用PBS浸洗 3 次，每次 5 min。4)向孔內(nèi)加入0.5%Triton X-100(PBS配制)室溫通透20min，目的是使細胞通透。5) 除去Triton X-100，使用PBS浸洗 3 次，每次 5 min。6)用10%的與二抗同源的山羊血清(PBS配制)或者5%BSA封閉2小時（選擇的封閉液與后面操作過程中抗體稀釋液一致）。封閉后不需要用PBS清洗。7)吸去封閉液，向每孔滴加足夠量適宜濃度的一抗（一次使用抗體可以根據(jù)抗體說明書推薦濃度，后續(xù)實驗可以摸索抗體的適宜濃度），4℃濕盒內(nèi)孵育過夜。免疫熒光技術可以用于研究藥物的靶點和作用機制。

免疫熒光的原理和類型：免疫熒光利用熒光分子或熒光團在一定波長（分子的吸收光譜）下吸收光子的特性，經(jīng)過短暫的間隔（發(fā)射光譜）后以較高的波長發(fā)射光子，并伴隨能量損失。發(fā)射的熒光可通過顯微鏡觀察到。熒光團可以通過可見光或紫外光激發(fā)。具有高光穩(wěn)定性和熒光量子產(chǎn)率的熒光染料可在市場上購買，其激發(fā)較大值跨越從400到>700nm的波長范圍。它們不會損傷活細胞，可安全用于生物制劑。在進行免疫熒光檢測時，首先對細胞或組織進行固定和透化處理。進行免疫染色時，熒光團與目標抗原的抗體結合，然后使用成像顯微鏡觀察熒光信號。根據(jù)使用的抗體和所需的信號擴增，免疫熒光可分為直接和間接兩種類型。免疫熒光技術可以用于研究代謝疾病和內(nèi)分泌系統(tǒng)的功能。MMP13免疫熒光IF

免疫熒光技術可以用于研究細胞內(nèi)分子的相互作用。Aggrecan免疫

直接免疫熒光：單抗體（一抗）用于免疫染色和檢測目標蛋白。熒光素結合的一抗直接與目標抗原結合，并使用成像顯微鏡觀察。直接免疫熒光的優(yōu)點：由于無需為兩種抗體選擇不同的物種反應性，從而降低了物種交叉反應性問題。與間接免疫熒光相比，時間縮短（操作步驟減少）。直接免疫熒光的缺點：不允許通過二抗進行信號放大；檢測靈敏度降低；熒光素結合一抗的選擇有限；與使用熒光二抗的檢測相比，更昂貴。間接免疫熒光：使用兩種抗體（一抗和二抗）進行免疫染色并檢測目標蛋白。首先，用特異性一抗標記目標蛋白。然后，熒光素結合的二抗（與一抗具有不同的物種反應性）識別結合的抗原-抗體復合物并與一抗結合。由于一個以上的二抗可以與一抗結合，熒光信號被放大，提供了更高的檢測靈敏度。Aggrecan免疫

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