免疫熒光實驗的注意事項：為了保證熒光染色的正確性，初次試驗時需設置下述對照，以排除某些非特異性熒光染色的干擾。①標本自發(fā)熒光對照：標本加1-2滴0.01mol/L，pH7.4的PBS。②特異性對照（抑制試驗）：標本加未標記的特異性抗體，再加熒光標記的特異性抗體。③陽性對照：已知的陽性標本加熒光標記的特異性抗體。如果標本自發(fā)熒光對照和特異性對照呈無熒光或弱熒光，陽性對照和待檢標本呈強熒光，則為特異性陽性染色。一般標本在高壓汞燈下照射超過3min，就有熒光減弱現(xiàn)象，經熒光染色的標本較好在當天觀察，隨著時間的延長，熒光強度會逐漸下降。免疫熒光技術可以用于研究代謝疾病和內分泌系統(tǒng)的功能。CRT(Calreticulin)免疫熒光

免疫熒光技術又稱熒光抗體技術，是標記免疫技術中發(fā)展較早的一種。它是在免疫學、生物化學和顯微鏡技術的基礎上建立起來的一項技術。很早以來就有一些學者試圖將抗體分子與一些示蹤物質結合，利用抗原抗體反應進行組織或細胞內抗原物質的定位。免疫熒光技術是標記免疫技術中發(fā)展較早的一種．它是在免疫學、生物化學和顯微鏡技術的基礎上建立起來的一項技術。Coons等于1941年初次采用熒光素進行標記抗體獲得成功。經過幾十年的發(fā)展，該技術已相當成熟。用熒光抗體示蹤或檢查相應抗原的方法稱熒光抗體法；用已知的熒光抗原標記物示蹤或檢查相應抗體的方法稱熒光抗原法。這兩種方法總稱免疫熒光技術。在實際工作中熒光抗原技術很少應用，所以人們習慣將熒光抗體技術稱為免疫熒光技術CRT(Calreticulin)免疫熒光熒光抗體標記使得抗原定位變得可視化，有助于觀察細胞結構和功能。

細胞免疫熒光可以觀察蛋白在細胞中的定位，以及一些特殊信號分子蛋白的出核/入核的定位變化。在進行細胞免疫熒光過程中，需要用到細胞爬片，通過將爬片浸在細胞培養(yǎng)基內，細胞在爬片上生長，進而進行細胞的免疫熒光。實驗前準備：1.胰酶;2.DMEM細胞培養(yǎng)基;3.細胞培養(yǎng)12孔板或者6孔板;4.爬片。間接免疫熒光的優(yōu)點：通過增加能夠與一抗結合的二抗數(shù)量進行信號放大；與直接免疫熒光相比，通過信號放大提高檢測靈敏度。免疫熒光技術是一種以熒光素標記抗體來定位抗原物質的高度發(fā)達的標記免疫技術。

免疫熒光法是將免疫學方法(抗原抗體特異結合)與熒光標記技術結合起來研究特異蛋白抗原在細胞內分布的方法。由于熒光素所發(fā)的熒光可在熒光顯微鏡下檢出，從而可對抗原進行細胞定位。用免疫熒光技術顯示和檢查細胞或組織內抗原或半抗原物質等方法稱為免疫熒光細胞(或組織)化學技術。免疫熒光細胞化學是根據(jù)抗原抗體反應的原理，先將已知的抗原或抗體標記上熒光素制成熒光標記物，再用這種熒光抗體(或抗原)作為分子探針檢查細胞或組織內的相應抗原(或抗體)。在細胞或組織中形成的抗原抗體復合物上含有熒光素，利用熒光顯微鏡觀察標本，熒光素受激發(fā)光的照射而發(fā)出明亮的熒光(黃綠色或桔紅色)，可以看見熒光所在的細胞或組織，從而確定抗原或抗體的性質、定位。熒光抗體法是利用熒光標記的抗體來追蹤或檢查相應抗原的方法。

直接免疫熒光：單抗體（一抗）用于免疫染色和檢測目標蛋白。熒光素結合的一抗直接與目標抗原結合，并使用成像顯微鏡觀察。直接免疫熒光的優(yōu)點：由于無需為兩種抗體選擇不同的物種反應性，從而降低了物種交叉反應性問題。與間接免疫熒光相比，時間縮短（操作步驟減少）。直接免疫熒光的缺點：不允許通過二抗進行信號放大；檢測靈敏度降低；熒光素結合一抗的選擇有限；與使用熒光二抗的檢測相比，更昂貴。間接免疫熒光：使用兩種抗體（一抗和二抗）進行免疫染色并檢測目標蛋白。首先，用特異性一抗標記目標蛋白。然后，熒光素結合的二抗（與一抗具有不同的物種反應性）識別結合的抗原-抗體復合物并與一抗結合。由于一個以上的二抗可以與一抗結合，熒光信號被放大，提供了更高的檢測靈敏度。免疫熒光技術利用熒光染料標記的抗體與目標分子結合，從而實現(xiàn)可視化檢測。CRT(Calreticulin)免疫熒光

免疫熒光技術可以通過熒光顯微鏡觀察樣品中的熒光信號，從而確定目標分子的存在和位置。CRT(Calreticulin)免疫熒光

其他熒光物質：1．酶作用后產生熒光的物質某些化合物本身無熒光效應，一旦經酶作用便形成具有強熒光的物質。例如4-甲基傘酮-β-D半乳糖苷受β-半乳糖苷酶的作用分解成4-甲基傘酮，后者可發(fā)出熒光，激發(fā)光波長為360nm，發(fā)射光波長為450nm。其他如堿性酸酶的底物4-甲基傘酮磷酸鹽和辣根過氧化物酶的底物對羥基乙酸等。2．鑭系螯合物某些3價稀土鑭系元素如銪（Eu3+）、鋱（Tb3+）、鈰（Ce3+）等的螯合物經激發(fā)后也可發(fā)射特征性的熒光，其中以Eu3+應用較廣。Eu3+螯合物的激發(fā)光波長范圍寬，發(fā)射光波長范圍窄，熒光衰變時間長，較適合用于分辨熒光免疫測定。所需要的儀器：熒光顯微鏡、顯微熒光分光光度計、流式細胞儀和時間分辨熒光計等儀器激光共聚焦顯微鏡。CRT(Calreticulin)免疫熒光

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