免疫熒光間接法測抗體實驗步驟：滴加0.01mol/L，pH7.4的PBS于已知抗原標本片，10min后棄去，使標本片保持一定濕度。滴加以0.01mol/L，pH7.4的PBS適當(dāng)稀釋的待檢抗體標本，覆蓋已知抗原標本片。將玻片置于有蓋搪瓷盒內(nèi)，37℃保溫30min。取出玻片，置于玻片架上，先用0.01mol/L，pH7.4的PBS沖洗1-2次，然后按順序過0.01mol/L，pH7.4的PBS三缸浸泡，每缸5min，不時振蕩。取出玻片，用濾紙吸去多余水分，但不使標本干燥，滴加一滴一定稀釋度的熒光標記的抗人球蛋白抗體。將玻片平放在有蓋搪瓷盒內(nèi)，37℃保溫30min。重復(fù)操作3。取出玻片，用濾紙吸去多余水分，滴加一滴緩沖甘油，再覆以蓋玻片。熒光顯微鏡高倍視野下觀察，結(jié)果判定同直接法。免疫熒光技術(shù)是將抗體與熒光素等示蹤物質(zhì)結(jié)合，通過抗原抗體反應(yīng)進行定位。CD163免疫熒光分析

免疫熒光檢測相對于酶檢測的優(yōu)勢：定量熒光信號的能力（與使用基于酶的方法進行的定性測定相反）；復(fù)用能力（可以結(jié)合不同發(fā)射光譜的熒光染料來檢測多種蛋白質(zhì)）；熒光染料的光穩(wěn)定性。免疫熒光技術(shù)是根據(jù)抗原抗體反應(yīng)的原理，先將已知的抗原或抗體標記上熒光素，制成熒光抗體，再用這種熒光抗體（或抗原）作為探針檢測組織或細胞內(nèi)的相應(yīng)抗原（或抗體）。在組織或細胞內(nèi)形成的抗原抗體復(fù)合物上含有標記的熒光素，利用熒光顯微鏡觀察標本，熒光素受外來激發(fā)光的照射而發(fā)生明亮的熒光（黃綠色或橘紅色），可以看見熒光所在的組織細胞，從而確定抗原或抗體的性質(zhì)、定位，以及利用定量技術(shù)測定含量。CD3免疫檢測熒光抗體技術(shù)具有高靈敏度和高特異性，可以實現(xiàn)精確的免疫檢測。

免疫熒光-實驗步驟：細胞爬片免疫熒光：在培養(yǎng)板中將已爬好細胞的玻片用PBS浸洗3次,每次5min;（圓蓋片：13mm24孔；18mm12孔；20mm6孔）用4%的多聚甲醛固定爬片15min,PBS浸洗玻片3次,每次5min0.5%TritonX-100(PBS配制)室溫通透20min(細胞膜上表達的抗原省略此步驟);PBS浸洗玻片3次,每次3min,吸水紙吸干PBS,在玻片上滴加3%的BSA（PBS配置）,室溫封閉30min5,吸水紙吸掉封閉液,不洗,每張玻片滴加足夠量用PBS稀釋好的一抗并放入濕盒,4℃孵育過夜。加熒光二抗:PBS浸洗爬片3次,每次5min,吸水紙吸干爬片上多余液體后滴加稀釋好的熒光二抗,濕盒中室溫孵育50min。

細胞的固定及免疫熒光：1)吸除培養(yǎng)基，一般先加入PBS浸洗細胞 3 次，每次 5 min。2)向孔內(nèi)加入4%多聚甲醛1ml，進行細胞固定，室溫固定20分鐘。3)吸去多聚甲醛，使用PBS浸洗 3 次，每次 5 min。4)向孔內(nèi)加入0.5%Triton X-100(PBS配制)室溫通透20min，目的是使細胞通透。5) 除去Triton X-100，使用PBS浸洗 3 次，每次 5 min。6)用10%的與二抗同源的山羊血清(PBS配制)或者5%BSA封閉2小時（選擇的封閉液與后面操作過程中抗體稀釋液一致）。封閉后不需要用PBS清洗。7)吸去封閉液，向每孔滴加足夠量適宜濃度的一抗（一次使用抗體可以根據(jù)抗體說明書推薦濃度，后續(xù)實驗可以摸索抗體的適宜濃度），4℃濕盒內(nèi)孵育過夜。熒光抗原法是利用已知的熒光標記物來追蹤或檢查相應(yīng)抗體的方法。

免疫熒光實驗的注意事項：對熒光標記的抗體的稀釋，要保證抗體的蛋白有一定的濃度，一般稀釋度不應(yīng)超過1：20，抗體濃度過低，會導(dǎo)致產(chǎn)生的熒光過弱，影響結(jié)果的觀察。染色的溫度和時間需要根據(jù)各種不同的標本及抗原而變化，染色時間可以從10min到數(shù)小時，一般30min已足夠。染色溫度多采用室溫（25℃左右），高于37℃可加強染色效果，但對不耐熱的抗原（如流行性乙型腦炎病毒）可采用0-2℃的低溫，延長染色時間。低溫染色過夜較37℃30min效果好的多。免疫熒光技術(shù)在免疫學(xué)研究中發(fā)揮重要作用，幫助揭示細胞和分子的功能和相互關(guān)系。CRT(Calreticulin)免疫熒光試驗

免疫熒光技術(shù)可以用于研究藥物的靶點和作用機制。CD163免疫熒光分析

免疫熒光實驗的注意事項：為了保證熒光染色的正確性，初次試驗時需設(shè)置下述對照，以排除某些非特異性熒光染色的干擾。①標本自發(fā)熒光對照：標本加1-2滴0.01mol/L，pH7.4的PBS。②特異性對照（抑制試驗）：標本加未標記的特異性抗體，再加熒光標記的特異性抗體。③陽性對照：已知的陽性標本加熒光標記的特異性抗體。如果標本自發(fā)熒光對照和特異性對照呈無熒光或弱熒光，陽性對照和待檢標本呈強熒光，則為特異性陽性染色。一般標本在高壓汞燈下照射超過3min，就有熒光減弱現(xiàn)象，經(jīng)熒光染色的標本較好在當(dāng)天觀察，隨著時間的延長，熒光強度會逐漸下降。CD163免疫熒光分析

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