密度梯度離心法根據(jù)在蔗糖、碘海醇或碘克沙醇等惰性溶液中的浮力密度將外泌體分成特定的層,目前普遍應(yīng)用的是蔗糖,這種方法可以成功地將亞細(xì)胞成分(例如過氧化物酶體,線粒體和核內(nèi)體)分離到密度梯度溶液中的不同層中。樣品被放置在梯度的頂部,當(dāng)施加離心力時(shí),樣品中的顆粒以獨(dú)特的速率通過梯度,該梯度以從上到下的密度增加。樣品中的外泌體將在1.13-1.19g/ml的密度范圍富集,隨后可以通過分餾收集,密度梯度超速離心對(duì)從蛋白質(zhì)聚集體和非膜顆粒中分離出外泌體非常有效。此方法獲得的外泌體純度較高,但步驟繁瑣、費(fèi)時(shí)且會(huì)造成外泌體損失。對(duì)外泌體的分析和檢測(cè)可以輔助疾病的早期診斷、療效評(píng)價(jià)和預(yù)后分析。河南外泌體質(zhì)譜
雖然系統(tǒng)遞送的外泌體主要在肝臟、腎臟和脾臟中積累,但通過在外泌體的外表面上展示特定的靶向分子。例如,識(shí)別靶抗原的肽或抗體片段,可以獲得靶向外泌體;通過在細(xì)胞分泌囊泡上展示糖基磷脂酰肌醇(GPI)錨定的納米抗體,可以使細(xì)胞分泌囊泡顯示多種蛋白,包括抗體、熒光蛋白和信號(hào)分子。自然分泌的外泌體分離純化直接作為藥物的潛力有限,但是,將自然的外泌體分泌所需組分摻入合成脂質(zhì)體或納米顆粒中,并且使用可控程序組裝后的工程化外泌體模擬物在藥學(xué)上擁有更大的應(yīng)用潛力。湖南外泌體PKH67外泌體研究使用血漿樣本進(jìn)行實(shí)驗(yàn)較好。
目前,在各種健康與疾病模型中都發(fā)現(xiàn),外泌體通過分子信息傳遞扮演著重要的角色。外泌體還越來越多地被認(rèn)為是疾病的生物標(biāo)志物和預(yù)后因子,具有重要的臨床診斷和治理意義。除此之外,它們還有潛力被用于臨床,作為基因和藥物遞送的載體。健康人和多種疾病的患者會(huì)將含有不同RNA和蛋白質(zhì)成分的外泌體釋放到體液循環(huán)中,因其特殊性,外泌體可以作為生物標(biāo)志物來對(duì)疾病進(jìn)行檢測(cè)。例如,從血液或尿液中分離的外泌體可以用作病癥、心臟病的診斷和預(yù)后的指標(biāo)。
外泌體的檢測(cè),在其他消化道系統(tǒng)瘤的診療中,存在著巨大的潛在價(jià)值.如:食管鱗狀細(xì)胞病的研究中發(fā)現(xiàn),miRNA-21在外泌體中的高表達(dá),表達(dá)水平可100%反應(yīng)瘤水平,外泌體miRNA-21的高表達(dá)往往預(yù)示著寬泛浸潤與復(fù)發(fā)[36].十二指腸病的研究中,發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)移性十二指腸病細(xì)胞分泌的外泌體富含PABP1蛋白,細(xì)胞不能耐受PABP在胞內(nèi)的大量囤積,通過外泌體PABP1蛋白排出胞外是轉(zhuǎn)移性十二指腸病細(xì)胞所具有的特性,外泌體PABP1是轉(zhuǎn)移性十二指腸病的分子標(biāo)志物,此發(fā)現(xiàn)不只在轉(zhuǎn)移性十二指腸病的診斷上提供了價(jià)值,也為轉(zhuǎn)移性十二指腸病的治理提供了新的思路。外泌體作為細(xì)胞間信號(hào)傳導(dǎo)的通訊工具和作為病等各種疾病的生物標(biāo)記話題比較熱門。
細(xì)胞分泌外泌體的過程一般分為三個(gè)階段:(1)質(zhì)膜內(nèi)陷,形成早期內(nèi)吞小泡;(2)內(nèi)吞小泡向內(nèi)萌發(fā)成熟,形成多囊泡體;(3)多囊泡體與質(zhì)膜融合,并釋放出囊泡內(nèi)容物,形成外泌體。外泌體具有獨(dú)特的理化性質(zhì),其密度為1.13~1.19g/mL,由平均厚度小于5nm的雙層脂膜所包裹,具有典型杯狀形態(tài),呈現(xiàn)為扁平球形。外泌體表面富含多糖鏈,其質(zhì)膜主要由溶血磷脂酸、磷脂酰絲氨酸、膽固醇、神經(jīng)酰胺和鞘磷脂構(gòu)成,另有與細(xì)胞來源相關(guān)的部分特殊脂類。外泌體可攜帶蛋白質(zhì)、核酸和脂質(zhì)等生物活性大分子,其中主要為蛋白質(zhì),且大部分蛋白為所有來源外泌體所共有,只有小部分與其來源有關(guān),為其分泌細(xì)胞的特有蛋白,能夠反映分泌細(xì)胞的類型和生理病理狀態(tài)。除此之外,外泌體可攜帶大量mRNA和miRNA等核酸,并將其運(yùn)輸?shù)桨屑?xì)胞,發(fā)揮相應(yīng)的生物學(xué)功能。在免疫系統(tǒng)中,據(jù)報(bào)道趨化因子受體CCR5通過外泌體在細(xì)胞之間轉(zhuǎn)移是細(xì)胞人類免疫缺陷病毒傳染的一種機(jī)制。瑞黎菲外泌體
外泌體的提取的方式:PS親和法。河南外泌體質(zhì)譜
外泌體中常見的細(xì)胞質(zhì)蛋白是Rabs蛋白,是鳥苷酸三磷酸酶家族的一種。它可以調(diào)節(jié)外泌體膜與受體細(xì)胞的融合,有文獻(xiàn)報(bào)道稱RAB4,RAB5和RAB11主要出現(xiàn)在早期以及回收的核內(nèi)體中,RAB7和RAB9主要出現(xiàn)在晚期的核內(nèi)體?,F(xiàn)有大量的研究發(fā)現(xiàn)外泌體中含有40種RAB蛋白。除了RAB蛋白,外泌體中富含具有外泌體膜交換以及融合作用的膜聯(lián)蛋白(包括膜聯(lián)蛋白1、2、4、5、6、7、11等)。外泌體膜上富含參與外泌體運(yùn)輸?shù)乃目缒さ鞍准易澹–D63,CD81和CD9))、熱休克蛋白家族((HSP60,HSP70,HSPA5,CCT2和HSP90以及一些細(xì)胞特異性的蛋白包括A33(結(jié)腸上皮細(xì)胞來源)、MHC-Ⅱ(抗原提呈細(xì)胞來源)、CD86(抗原提呈細(xì)胞來源)以及乳凝集素。河南外泌體質(zhì)譜
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