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北京外泌體示蹤

來源: 發(fā)布時(shí)間:2023-04-11

超速離心是外泌體提取較常用的方法也被認(rèn)為是金標(biāo)準(zhǔn),主要是根據(jù)外泌體的沉降系數(shù)、大小和形狀將其分離出來。首先4℃低速離心(300-500g,10min)去除死細(xì)胞以及細(xì)胞碎片,隨后以較高離心速度(2000xg,10min)去除生物聚合物以及凋亡小體,然后用10000xg,30min離心去除大型囊泡,結(jié)尾以超速離心沉淀外泌體。通過懸浮以及重復(fù)超速離心去除外泌體沉淀中的非外泌體蛋白。超速離心法具有操作簡單、不易被分離試劑污染、獲得的外泌體數(shù)量較多等優(yōu)點(diǎn)。但是此方法需要昂貴的超高速離心機(jī),每次處理的樣本量較小,費(fèi)時(shí),電鏡鑒定時(shí)還發(fā)現(xiàn)外泌體易聚集成塊,且上清中仍能檢測到大型囊泡,純度不高,另外高速離心會(huì)損傷外泌體影響下游實(shí)驗(yàn)。多種細(xì)胞在正常及病理狀態(tài)下均可分泌外泌體。北京外泌體示蹤

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當(dāng)外泌體在1980年初次被發(fā)現(xiàn)后,其被認(rèn)為是細(xì)胞排泄廢物的一種方式,如今隨著大量對(duì)其生物來源、其物質(zhì)構(gòu)成及運(yùn)輸、細(xì)胞間信號(hào)的傳導(dǎo)以及在體液中的分布的研究發(fā)現(xiàn)外泌體具有多種多樣的功能。外泌體的功能取決于其所來源的細(xì)胞類型,其可參與到機(jī)體免疫應(yīng)答、抗原提呈、細(xì)胞遷移、細(xì)胞分化、肉瘤侵襲等方方面面。有研究表明肉瘤來源的外泌體參與到肉瘤細(xì)胞與基底細(xì)胞的遺傳信息的交換,從而導(dǎo)致大量新生血管的生成,促進(jìn)了肉瘤的生長與侵襲。唾液提取試劑盒廠家疾病的進(jìn)展和對(duì)診療的反應(yīng)可以通過外泌體的多組分分析來確定。

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細(xì)胞外囊泡是蛋白質(zhì)、mRNA、miRNA和脂質(zhì)運(yùn)輸來完成細(xì)胞間通訊通路的重要媒介,根據(jù)它們的大小和發(fā)生分為三類,包括外泌體、微泡和凋亡小體。其中,外泌體是直徑大約為40-100nm的包裝囊泡,由多種細(xì)胞分泌,內(nèi)含有特定的蛋白質(zhì)、脂質(zhì)、細(xì)胞因子或遺傳物質(zhì)。來源于不同的組織的外泌體不只具有其特異性蛋白分子,而且還包含其行使功能的關(guān)鍵分子。近年來,隨著外泌體研究的不斷深入,它的應(yīng)用已經(jīng)涉及瘤子診療領(lǐng)域、醫(yī)學(xué)基礎(chǔ)和免疫領(lǐng)域、寄生蟲領(lǐng)域;臨床研究上已涉及心血管系統(tǒng)、內(nèi)分泌代謝系統(tǒng)等。

細(xì)胞攝取診療性外泌體:從樹突狀細(xì)胞、成纖維細(xì)胞和間充質(zhì)細(xì)胞中分離出的診療性外泌體可對(duì)靶細(xì)胞產(chǎn)生特定的作用,包括新抗原呈遞、免疫調(diào)節(jié)和藥物有效載荷傳遞。診療性外泌體對(duì)靶細(xì)胞的影響可能是通過不同的進(jìn)入或相互作用機(jī)制來控制的。完整的外泌體的進(jìn)入可能包括受體介導(dǎo)的內(nèi)吞作用、網(wǎng)格蛋白包被小凹、脂筏、吞噬作用、小凹和大胞飲作用。外泌體內(nèi)容物的進(jìn)入或外泌體信號(hào)的誘導(dǎo)可能涉及配體受體誘導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)信號(hào)或融合,從而將外泌體內(nèi)容物沉積到細(xì)胞質(zhì)中。外泌體是分泌的細(xì)胞外囊泡的主要群體,是具有生物活性的脂雙層囊泡。

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外泌體的提取主要包括以下幾種方式:1、免疫磁珠法,這種方法可以保證外泌體形態(tài)的完整,特異性高、操作簡單、不需要昂貴的儀器設(shè)備,但是非中性pH和非生理性鹽濃度會(huì)影響外泌體生物活性,不便進(jìn)行下一步的實(shí)驗(yàn)。2、PS親和法,該方法將PS(磷脂酰絲氨酸)與磁珠結(jié)合,利用親和原理捕獲外泌體囊泡外的PS。該方法與免疫磁珠法相似,獲得的外泌體形態(tài)完整,純度較高。由于不使用變性劑,不影響外泌體的生物活性,外泌體可用于細(xì)胞共培養(yǎng)和體內(nèi)注射。3、色譜法,這種方法分離到的外泌體在電鏡下大小均一,但是需要特殊的設(shè)備,應(yīng)用不普遍。外泌體作為核酸的藥物遞送載體。外泌體的作用是消除廢物并介導(dǎo)大腦活動(dòng),從而阻止神經(jīng)退行性疾病的發(fā)病機(jī)理。外周血外泌體提取試劑盒步驟

外泌體的提取的方式:超速離心法。北京外泌體示蹤

磁珠免疫法分離外泌體:將針對(duì)目的抗原的抗體通過生物素-鏈霉親和素連接到磁珠表面,然后將磁珠與樣品共孵育,使外泌體特異性結(jié)合到磁珠上形成磁珠-外泌體復(fù)合物,再用蒸餾水或者PBS沖洗,結(jié)尾用甘氨酸-Tris-HCl溶液洗脫獲得外泌體。該方法相對(duì)于ELISA的好處主要是,珠粒提供了更大的表面積來捕獲外泌體,從而提高了分離效率。此外,使用磁珠時(shí),樣品起始體積沒有上限,而基于微孔板的ELISA分析的較大樣品體積為100μL,且ELISA洗脫雜質(zhì)時(shí)容易造成孔間交叉污染。當(dāng)將磁珠法與金標(biāo)準(zhǔn)外泌體分離方法進(jìn)行比較時(shí),磁珠法可分離出更純凈的外泌體,特異性高、速度更快,并且不需要昂貴的儀器。另外,與其他分離方法(如超速離心或超濾)相比,磁珠法不影響外泌體形態(tài)。但是采用磁珠法時(shí),外泌體生物活性易受PH和鹽濃度影響。北京外泌體示蹤

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