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外泌體提取實驗

來源: 發(fā)布時間:2023-04-06

外泌體是細胞分泌到胞外的一種囊泡,其大小為30-150nm,具有雙層膜結構和茶托狀形態(tài),含有豐富的內含物(包括核酸、蛋白和脂質等),參與細胞間的分子傳遞。外泌體普遍存在于細胞培養(yǎng)上清以及各種體液中,包括血液、唾液、尿液、乳汁等,同時也存在于組織樣本中,如腦組織、肌肉組織、脂肪組織等。所有的細胞都能分泌外泌體,但是不同細胞分泌的外泌體不管在數量上還是在內含物中都具有比較大的差異性,這也決定了每種外泌體所行使的功能不一樣。外泌體普遍參與細胞間物質運輸與信息傳遞,調控細胞生理活動。同時,外泌體具有抗原提呈、免疫逃逸、誘導正常細胞轉化、促進瘤子發(fā)生和轉移等作用;此外,外泌體還可以作為“天然的納米粒子”來進行藥物遞送。外泌體的膜蛋白有可能與細胞膜蛋白作用,活躍細胞內通路。外泌體作為一個新型的研究熱點,由于它在體內存在的普遍性和獲取的便捷性。外泌體提取實驗

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外泌體的提取主要包括以下幾種方式。一是超速離心法,這是目前外泌體提取較常用的方法。此種方法得到的外泌體量多,但是純度不足,電鏡鑒定時發(fā)現(xiàn)外泌體聚集成塊,由于微泡和外泌體沒有非常統(tǒng)一的鑒定標準,也有一些研究認為此種方法得到的是微泡不是外泌體。二是過濾離心,這種操作簡單、省時,不影響外泌體的生物活性,但同樣存在純度不足的問題。三是密度梯度離心法,用此種方法分離到的外泌體純度高,但是前期準備工作繁雜,耗時,量少。膜受體的識別是外泌體細胞反應的基礎,它可能活躍受體并隨后導致相關信號通路的活躍。外泌體細胞培養(yǎng)外泌體的提取的方式:免疫磁珠法。

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被特定部位的細胞獲取的瘤子外泌體可為腫細胞的轉移準備轉移前微環(huán)境。用肺轉傾向的腫細胞細胞來源的外泌體處理小鼠后可使骨轉傾向的腫細胞細胞重新定向。外泌體的蛋白質組學分析發(fā)現(xiàn)不同部位傾向性的腫細胞細胞來源的外泌體具有不同的整合素(integrin)表達譜,整合素α6β4和α6β1與肺轉有關,而整合素αvβ5與肝轉有關。敲低整合素α6β4和αvβ5可減少外泌體被靶部位細胞獲取,進而分別降低了肺和肝的轉移。進一步研究發(fā)現(xiàn)外泌體整合素被細胞獲取后活躍了Src的磷酸化和促炎的S100基因的表達。通過臨床數據分析顯示外泌體整合素可作為預測腫細胞轉移的部位傾向性的診斷指標。外泌體的提取的方式:PS親和法。

外泌體研究背景:胞外囊泡是從細胞膜上脫落或者由細胞分泌的具有雙層膜結構的囊泡狀小體,主要由微囊泡、凋亡小體、外泌體組成。而外泌體是其中一類小囊泡,直徑為30~150nm,密度1.10~1.18g/ml,可攜帶核酸、蛋白質質和脂質等,存在于血液、唾液、尿液等多種體液中。越來越多的研究證實,外泌體可以通過細胞間轉移核酸、蛋白質、脂質等特定物質,發(fā)揮特殊的功能。如在抗原提呈細胞中呈遞抗原程中、腫細胞細胞發(fā)生了發(fā)展、神經細胞信號轉導過程中都發(fā)揮著重要作用。對外泌體的分析和檢測可以輔助疾病的早期診斷、療效評價和預后分析。外泌體可通過其攜帶的蛋白質、核酸、脂類等來調節(jié)受體細胞的生物學活性。超速離心法,這是目前外泌體提取較常用的方法。

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NTA技術已被作為外泌體表征手段之一,相較于其他表征方式NTA技術的樣本處理更簡單、更能保證外泌體原始狀態(tài)、檢測速度更快。大致方法是:將分離的外泌體樣本注入納米顆粒追蹤分析儀,用激光光束穿過樣本,激光在腔室內與顆粒相互作用時會發(fā)生散射,通過裝有攝像頭的顯微鏡收集散射光,捕捉外泌體的布朗運動,實現(xiàn)顆??梢暬?。然后使用Stokes-Einstein方程來測量粒子的平均速度,繼而估算粒子的大小。NTA能夠測量粒徑10-1000nm之間的顆粒,包含了外泌體50-150nm的徑粒范圍,但是NTA鑒定需要大于0.5毫升的樣品體積以及優(yōu)化的數據收集和分析參數,另外,NTA比較難區(qū)分與外泌體具有相似布朗運動的蛋白質聚集體,因此無法排除其他物質干擾。外泌體是細胞分泌的納米級膜微粒,能在細胞與細胞之間傳遞信息。正青春外泌體

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外泌體生物學功能:1、在心血管系統(tǒng)中,據報道,源自人胚胎干細胞(ESC)的間充質干細胞(MSC)外泌體可減少小鼠和豬模型中的心肌缺血和再灌注損傷;2、在免疫系統(tǒng)中,據報道趨化因子受體CCR5通過外泌體在細胞之間轉移是細胞人類免疫缺陷病毒傳染的一種機制;3、在中樞的神經系統(tǒng)(CNS)中,外泌體的作用是消除廢物并介導大腦活動,從而阻止神經退行性疾病的發(fā)病機理;迄今為止,尚未完全發(fā)現(xiàn)調節(jié)外泌體-細胞結合的途徑。然而,比較明顯,其結合過程從外泌體識別受體細胞PM上的特定受體開始。膜受體的識別是外泌體細胞反應的基礎,它可能活躍受體并隨后導致相關信號通路的活躍,外泌體與PM融合或外泌體的內吞作用,從而導致蛋白質和RNA直接釋放到受體細胞中。從研究上來講并不太嚴格區(qū)分外泌體或微泡。外泌體提取實驗

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