PCR實驗技術(shù)中的RT-PCR一步法和兩步法的優(yōu)缺點介紹：一步法：利用同一緩沖液，在同一體系中加入逆轉(zhuǎn)錄酶、引物、Taq酶、4種dNTP直接進(jìn)行mRNA反轉(zhuǎn)錄與PCR擴增。發(fā)現(xiàn)Taq酶不僅具有DNA多聚酶的作用，而且具有反轉(zhuǎn)錄酶活性，可利用其雙重作用在同一體系中直接以mRNA為模板進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄和其后PCR擴增，從而使mRNA的PCR步驟更為簡化。所需樣品量減少到比較低限度，臨床小樣品的檢測非常有利。用一步法擴增可檢測出總RNA中小于1ng的低豐度mRNA.該法可用于低豐度mRNA的cDNA文庫的構(gòu)建及特異cDNA的克隆，并有可能與Taq酶的測序技術(shù)相組合，使得自動反轉(zhuǎn)錄、基因擴增與基因轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的測序在單管中進(jìn)行。兩步法：由于單管反應(yīng)時RT和PCR都不能在比較好條件下進(jìn)行并且容易相互干擾，常只適宜用基因特異引物擴增較短的基因，及定量PCR.兩步法則是將RT和PCR分別進(jìn)行，這樣使得兩個反應(yīng)充分發(fā)揮各自的特點，更為靈活而且嚴(yán)謹(jǐn)，適合那些GC含量、二級結(jié)構(gòu)嚴(yán)重的模板或者是未知模板，以及多個基因的RT-PCR。熒光定量pcr正常值多少？黑龍江細(xì)胞pcr哪家好

PCR技術(shù)的基本原理類似于DNA的天然復(fù)制過程，DNA的半保留復(fù)制是生物進(jìn)化和傳代的重要途徑。其特異性依賴于與靶序列兩端互補的寡核苷酸引物。PCR由變性-退火-延伸三個基本反應(yīng)步驟構(gòu)成：①模板DNA的變性：模板DNA經(jīng)加熱至93℃左右一定時間后，使模板DNA雙鏈或經(jīng)PCR擴增形成的雙鏈DNA解離，使之成為單鏈，以便它與引物結(jié)合，為下輪反應(yīng)作準(zhǔn)備；②模板DNA與引物的退火（復(fù)性）：模板DNA經(jīng)加熱變性成單鏈后，溫度降至55℃左右，引物與模板DNA單鏈的互補序列配對結(jié)合；③引物的延伸：DNA模板-引物結(jié)合物在72℃、DNA聚合酶（如TaqDNA聚合酶）的作用下，以dNTP為反應(yīng)原料，靶序列為模板，按堿基互補配對與半保留復(fù)制原理，合成一條新的與模板DNA鏈互補的半保留復(fù)制鏈，重復(fù)循環(huán)變性-退火-延伸三過程就可獲得更多的“半保留復(fù)制鏈”，而且這種新鏈又可成為下次循環(huán)的模板。每完成一個循環(huán)需2～4分鐘，2～3小時就能將待擴目的基因擴增放大幾百萬倍組織pcr怎么樣一步法熒光定量pcr在哪做？

PCR實驗技術(shù)中的高GC含量PCR（GC-richPCR）介紹：具有高GC含量（>65%）的模板由于G和C堿基間的強氫鍵影響，比較難以擴增。高GC含量序列同時也涉及二級結(jié)構(gòu)。因此，高GC含量序列可使DNA聚合酶在擴增時卡住，從而影響了DNA的合成。為了擴增高GC含量片段，雙鏈模板必須分離，以便引物結(jié)合及DNA聚合酶讀取序列。為了克服強GC相互作用，較常用的方法是依靠PCR添加劑或共溶劑來幫助DNA變性（圖6A），如DMSO。這些試劑通常會降低引物的Tm，所以退火溫度也需做相應(yīng)的調(diào)整。高合成能力的DNA聚合酶由于其與模板的強結(jié)合能力，有助于高GC含量模板的PCR擴增（圖6B）。高熱穩(wěn)定性DNA聚合酶也有益于高GC含量PCR擴增，因為更高的變性溫度（如98℃代替95℃）可促進(jìn)解鏈和PCR擴增。

PCR出現(xiàn)假陽性的原因分析。引物設(shè)計不合適：選擇的擴增序列與非目的擴增序列有同源性，因而在進(jìn)行PCR擴增時，擴增出的PCR產(chǎn)物為非目的性的序列。靶序列太短或引物太短，容易出現(xiàn)假陽性。需重新設(shè)計引物。靶序列或擴增產(chǎn)物的交叉污染：這種污染有兩種原因：一是整個基因組或大片段的交叉污染，導(dǎo)致假陽性。這種假陽性可用以下方法解決：①操作時應(yīng)小心輕柔，防止將靶序列吸入加樣器內(nèi)或濺出離心管外。②除了酶及其他不耐高溫的物質(zhì)外，所有試劑或器材均應(yīng)高壓消毒。所用離心管均應(yīng)一次性使用。③必要時，在加標(biāo)本前，反應(yīng)管和試劑用紫外線照射，以破壞存在的核酸。二是空氣中的小片段核酸污染，這些小片段比靶序列短，但有一定的同源性?？苫ハ嗥唇樱c引物互補后，可擴增出PCR產(chǎn)物，而導(dǎo)致假陽性的產(chǎn)生，可用巢式PCR方法來減輕或消除。做pcr檢測，需要注意哪些事項？

PCR由變性--退火--延伸三個基本反應(yīng)步驟構(gòu)成：

1、模板DNA的變性：模板DNA經(jīng)加熱至93℃左右一定時間后，使模板DNA雙鏈或經(jīng)PCR擴增形成的雙鏈DNA解離，使之成為單鏈，以便它與引物結(jié)合，為下輪反應(yīng)作準(zhǔn)備。

2、模板DNA與引物的退火（復(fù)性）：模板DNA經(jīng)加熱變性成單鏈后，溫度降至55℃左右，引物與模板DNA單鏈的互補序列配對結(jié)合。3、引物的延伸：DNA模板--引物結(jié)合物在72℃、DNA聚合酶（如TaqDNA聚合酶）的作用下，以dNTP為反應(yīng)原料，靶序列為模板，按堿基互補配對與半保留復(fù)制原理，合成一條新的與模板DNA鏈互補的半保留復(fù)制鏈。重復(fù)循環(huán)變性--退火--延伸三過程就可獲得更多的“半保留復(fù)制鏈”，而且這種新鏈又可成為下次循環(huán)的模板。每完成一個循環(huán)需2～4分鐘，2～3小時就能將待擴目的基因擴增放大幾百萬倍 熒光定量pcr的原理和步驟是什么？新疆高效pcr實驗室

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pcr是一種在體外擴增特定DNA序列的技術(shù)方法，通過與特定DNA區(qū)域兩端互補的寡核苷酸為引物（primer）在試管中DNA聚合酶選擇性地單獨復(fù)制合成介于兩引物直接的基因片段，如同DNA復(fù)制中的半保留復(fù)制一樣，新合成的基因片段與模板鏈形成新的DNA雙鏈，經(jīng)反復(fù)的變性（denature）引物退火（anerling）和引物延伸（extention）三步循環(huán)，前一循環(huán)合成的DNA鏈成為下一循環(huán)引物結(jié)合的模板，每循環(huán)一次，反應(yīng)體系的DNA的量就增加一倍，20-30次反復(fù)循環(huán)，即可由微量的DNA模板開始獲得大量的DNA特異片段。近年來，PCR迅速發(fā)展，已深入生命科學(xué)的各個領(lǐng)域，技術(shù)方法不端完善，基本的PCR實驗技術(shù)主要有經(jīng)典PCR技術(shù)、RT-PCR技術(shù)、免疫-PCR技術(shù)、PCR-SSCP技術(shù)等。黑龍江細(xì)胞pcr哪家好

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